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细胞培养指南——技术和方案

发布时间:2021-05-19   点击次数:299次

细胞培养指南——技术和方案

哺乳动物细胞组织培养技术指南。涵盖大量关于哺乳动物细胞系的维持、分裂和细胞保存的信息。请注意,所有细胞培养必须使用无菌技术在层流罩中进行。

1.引言

细胞培养是细胞和分子生物学中使用的关键工具,可以对细胞的生理学和生物化学进行建模。此外,细胞培养使研究人员能够确定药物和有毒化合物对细胞反应的影响。由于使用一批克隆细胞可获得一致和可重复的结果,细胞培养仍然是当今研究中使用最广泛的技术之一。

来自动物或植物的细胞在有利环境中的生长被称为细胞培养。不同的细胞有不同的培养要求,为了达到最佳的生长效果,可以通过培养基的选择和补充剂来满足。所用介质的作用是提供必需的营养物质(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素、气体(O2、 CO2),并调节物理化学环境(pH值、渗透压、温度)。

1.2 原代培养vs细胞系

原代培养是指在组织分离后直接进行培养的细胞。一旦这些细胞汇合,即会占据烧瓶中所有可用空间,此时就需要将它们转移到一个新的生长容器中进行传代或分割,这将为细胞提供更多的继续生长和扩展的空间。第一次传代后,原代培养现在成为所谓的细胞系。源自原代培养的细胞系寿命有限,这意味着它们在衰老之前只能分裂有限的次数。

由于细胞被传代,生长能力最强的细胞占优势,导致群体的基因型和表型一致。永生细胞系广泛用于细胞和分子生物学,以绕过衰老等问题。细胞可以通过多种不同方式转化并永生。自发地、化学地或病毒地。一旦转化,这些细胞就获得了无限分裂的能力,成为一个连续的细胞系。

1.3 贴壁细胞和悬浮细胞

细胞系可以是:

1.贴壁(贴壁依赖性)——贴壁细胞必须在附着于固体或半固体底物上时进行培养,通常需要胰蛋白酶法进行亚培养(更多信息请参见2.6)。

2.悬浮(与锚固无关)——悬浮细胞不需要固体生长底物,可以悬浮在培养基中生长。

2. 细胞培养指南

以下是细胞系培养的通用指南。所有细胞培养必须在微生物安全柜中进行,使用无菌技术确保无菌。研究人员必须全程穿着防护服。

2.1 无菌技术和层流罩的制备

良好的无菌技术旨在创建无菌环境,并充当微生物与无菌细胞培养罩之间的屏障。该技术的关键包括使用无菌试剂和培养基。无菌操作确保未经过70%乙醇喷洒过的任何物体进入罩内。

层流罩制备

细胞培养罩可提供无菌工作区,同时可确保控制微生物程序产生的任何传染性飞溅物或气溶胶。细胞培养罩有3种类型,分别为I级、II级和III级,这些都是为了满足不同的研究和生物安全需求而开发的。请根据实验需求选择合适的产品。

使用层流罩

步骤程序

1.

取下盖子并打开层流罩。

2.

将层流罩窗扇关闭至适当位置,以保持层流空气。

3.

用70%的乙醇喷洒层流罩的所有表面区域。

4.

避免混乱。

5.

确保所有使用的设备(即移液器吸头、移液器、机架、Eppendorf管、烧瓶、试剂)是无菌的,然后再把它们放在罩子里。这可以通过高压灭菌或通过使用购买的预高压灭菌的不含DNAse / RNAse的设备来完成。用70%乙醇喷洒移液器和机架。

6.

所有介质、补充剂和试剂必须无菌,以防止微生物在细胞培养物中生长。如果一些试剂和补充剂没有提供无菌,将需要对它们进行过滤消毒。

7.

避免直接从瓶或烧瓶中倒入介质和试剂。

8.

每个移液器只使用一次,以避免交叉污染。

9.

在准备使用移液器,并在罩内进行之前,不要拆开无菌移液器的包装。

10.

只有在准备使用时才可以揭开无菌烧瓶、瓶子、培养皿等的盖子,切勿让其暴露在环境中。使用完后应立即将盖子放回原处。

11.

如果要取下盖子,并且必须将其放在工作面上,则将盖子的开口朝上放置。

2.2 细胞生长培养基的制备

在开始之前,确保针对感目标细胞系使用正确的培养基类型和培养补充剂。这些必须始终是无菌的,并且只能在罩内打开。大多数细胞系可以使用Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培养基或含10%胎牛血清(FBS)的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培养基。如果需要,可以添加2mM 谷氨酰胺和抗生素。

如何准备DMEM介质

步骤程序

1.

从500mL的瓶子中取出50mL的介质。

2.

现在的体积为450mL。

3.

加入10%FBS = 50mL。

4.

加入补充剂2 mM谷氨酰胺= 5mL,100 U青霉素/ 0.1mg/mL链霉素=5mL。


2.3 创造正确的培养环境

某些内皮细胞系需要特殊的胶原蛋白基质才能生长。这些基质确保细胞系的附着、分化和生长。在开始细胞培养实验之前,重要的是对目标胞系进行文献调查,以确保满足任何额外的生长要求,如基质。请注意所用烧瓶的类型,即通气或不通气。如果使用非通气/塞瓶烧瓶,请确保松开盖子以进行气体交换。如果使用通气烧瓶,请确保过滤器不会弄湿,因为这会影响气体交换的效率。

如何为内皮和上皮细胞制备1%明胶基质

步骤程序

1.

通过用蒸馏水稀释,然后过滤,制备10mL的由1%明胶/1%纤连蛋白组成的包衣溶液。

2.

这可覆盖约5个烧瓶。

3.

吸取包衣溶液到烧瓶中

4.

来回摇动以将基质均匀分布在烧瓶上。

5.

放在培养箱中静置15-30分钟

6.

在接种前用吸气的方法彻底清除包衣溶液。


2.4 检查细胞

每天应在显微镜下检查细胞,以确保它们健康并按预期生长。熟悉显微镜下健康细胞的外观非常重要,因为这将使通过形态变化检测静止或感染的细胞更加容易。

如果出现以下情况,请丢弃细胞:

步骤程序

1.

介质从粉红色/红色变为暗黄色。这是感染的迹象,并使用无菌技术。

2.

如果贴壁细胞大量脱落,则表明细胞死亡。

3.

如果细胞的外观发生了显着变化——看起来散乱而呈现颗粒状。

4.

如果它们静止。


2.5 分裂细胞

哺乳动物细胞汇合时应分裂/传代,这在烧瓶中70-80%的面积被细胞覆盖时发生。在贴壁细胞中,当没有可见的空间可用于细胞生长时,可以在显微镜下观察到汇合。对于悬浮细胞,当细胞凝聚在一起时,可以注意到汇合,并且当烧瓶旋转时,培养基看起来会混浊。

重要的是,不要让细胞过度汇合,以70-80%的汇合为最佳量,在这种情况下,接触抑制作用开始生效,并且细胞在重新接种后需要更长的恢复时间。细胞系生长的速度将决定所使用的分裂比。例如,如果以高比例分裂,生长缓慢的细胞系将不能很好地发挥作用。

快速生长的细胞系可能需要较高的分裂比例,因为与生长较慢的细胞系相比,它们需要更短的时间达到汇合。通常,细胞分裂的比例不应超过1:10,因为这对于细胞而言太低,将是细胞无法生存。改变培养物的接种密度可确保细胞在特定的一天准备好进行实验。

作为通用指南,一个汇合烧瓶中的细胞:70-80%的汇合分裂比例应为1:2,并准备在1-2天进行实验。70-80%的汇合分裂比例应为1:5,并准备在2-4天进行实验。70-80%的汇合分裂比例应为1:10,并准备在4-6天进行亚培养或电镀。但这可能取决于细胞系的生长速率。

1细胞培养物稀释液1

2细胞培养物稀释液2

2.6 分裂细胞方案

步骤程序

1.

确保细胞至少汇合80%。

2.

将新鲜细胞培养基在37℃的水浴或培养箱中加热至少30分钟。

3.

确保烧瓶正确标有代号、细胞系、分裂比例和日期。

4.

准备一个装有漂白剂的废料容器,以容纳大约100mL的10%次氯酸钠废液。


2.6.1 对于松散粘附的细胞(细胞刮除)

步骤程序

1.

小心地将介质倒入垃圾箱。

2.

在烧瓶中加入等体积的预热新鲜培养基。

3.

使用细胞刮刀将细胞从烧瓶底部轻轻刮入培养基中。

4.

确保已从烧瓶上刮下所有细胞。

5.

使用血清移液器取出所需量的细胞悬液。例如,对于1:2分裂,从100mL中取出50mL倒入新的烧瓶中;对于1:5分裂,从100mL中取出20mL倒入新的烧瓶中;对于1:10分裂,从100mL中取出10mL倒入新的烧瓶中;

6.

将所需的体积(考虑分裂比例)添加到预热的新鲜培养基中。例如在25cm2的烧瓶中加入约5-10mL;75cm2的烧瓶中加入约10-30mL;175cm2的烧瓶中加入约40-150mL。


2.6.2 对于贴壁细胞(胰蛋白酶)

步骤程序

1.

小心地将介质从烧瓶中倒入废液容器。

2.

使用无菌技术,将预热的PBS移液到烧瓶中,以洗涤细胞并除去任何残留的介质和FBS。

3.

轻轻前后摇动烧瓶,用PBS冲洗细胞,然后倒入废液容器中。重复3次。除去任何残留的FBS对于有效的胰蛋白酶消化很重要。

4.

洗涤完成后,添加胰蛋白酶EDTA(也已预热)。应该使用足够的胰蛋白酶以覆盖细胞。对于25cm2的烧瓶约1mL;75cm2的烧瓶约5mL;175cm2的烧瓶约10mL。

5.

像使用PBS一样,轻轻摇动烧瓶,以确保胰蛋白酶与所有细胞接触。

6.

将烧瓶放入37℃的培养箱中。不同的细胞系需要不同的胰蛋白酶消化时间。为避免过度胰蛋白酶消化严重破坏细胞,必须在显微镜下每隔几分钟检查一次,同时轻敲烧瓶以使细胞脱落。

7.

一旦细胞脱落,向烧瓶中加入一些培养基。培养基中的FBS将使胰蛋白酶失活。

8.

轻轻地在烧瓶壁上上下移液,以去除所有其他粘附细胞。

9.

计数细胞,将所需体积的细胞移液到新的烧瓶中。然后应在这些烧瓶中加满培养基至所需体积。例如在25cm2的烧瓶中加入约5-10mL;75cm2的烧瓶中加u人约10-30mL;175cm2的烧瓶中加入约40-150mL。

10.

过夜放置细胞以使其恢复并稳定下来。

* 胰蛋白酶消化可能对有些细胞有毒。它还可以诱导某些膜蛋白的暂时内在化,在设计实验时应予以考虑。在这些情况下,通常可以使用其他方法(例如温和的细胞刮擦或使用清洁剂)代替。

2.6.3 对于悬浮细胞

步骤程序

1.

一些悬浮细胞系有建议的分裂比例或传代细胞密度。开始实验之前请检查相关内容。

2.

使用移液器从烧瓶中取出所需量的细胞悬液,然后放入新的烧瓶中。例如,对于1:2分裂,从100mL细胞悬液中取出50mL;对于1:5分裂,从100mL细胞悬液中取出20mL

3.

将所需量的预热细胞培养基添加到新鲜的烧瓶中。例如,对于1:2分裂,从100mL细胞悬液中取出的50mL,加入50mLs的新鲜介质。对于1:5分裂,从100mL细胞悬液中取出的20mL,加入80mLs的新鲜介质。


2.7 更换介质

如果细胞已经生长了几天,但汇合程度不足以分裂,则必须更换介质以补充营养并保持pH值。

对于贴壁细胞

步骤程序

1.

在水浴箱或培养箱中使用介质之前,对其预热至少30分钟。

2.

将旧介质倒入垃圾箱。

3.

用相同体积预热过的新培养基更换,然后放回培养箱。

 

对于悬浮细胞

步骤程序

1.

在水浴箱或培养箱中使用介质之前,对其预热至少30分钟。

2.

将含有细胞的介质倒入15mL或50mL的离心管中并离心。转速和离心时间可能会因细胞系而异。

3.

离心后,细胞应会沉淀在管的底部,将旧介质倒入废物中,然后将沉淀重新悬浮在相同体积的介质中。

4.

放入新鲜的烧瓶中,并放回培养箱。


2.8 传代数

传代数是细胞经历的传代培养的次数。应记录传代数并且传代数不应太高。与低传代细胞相比,传代数大于30的细胞系更有可能获得遗传异常(Esquenet et al., 1997; Lin et al., 2003; O’Driscoll et al., 2006)。

P30通常被认为是培养中某些细胞传代的上限,因为进一步培养可能会导致分子谱的显着变化,限制其在体内的应用和可重复性(Calles et al., 2006; O’Driscoll et al., 2006; Wenger et al., 2004)。

2.9 冷冻细胞

冷冻细胞系是细胞培养的重要组成部分,因为更换细胞系既昂贵又费时,而且还可以确保如果细胞被感染,还将拥有备用库存并可以重新开始。一旦有多余的细胞可用,最好是低传代数以限制遗传漂变,就应将其冷冻为接种库存。然后可以从接种库存中准备使用的细胞。

冷冻保存细胞的最佳和最广泛使用的方法是将它们保存在带有冷冻保护剂,例如二甲基亚砜(DMSO)的液氮中。冷冻保护剂(例如DMSO)降低了培养基的凝固点并降低了冷却速度,从而大大降低了冰晶形成的风险,而该冰晶会导致细胞死亡和损坏。配置细胞冻存液需要培养基,血清和DMSO,按照一定比例配置。费事费时费力。靶点科技有现成直接使用的Bambanker无血清细胞冻存液(货号BB01),可以直接放到-80,无需梯度程序降温。

冷冻细胞方案

步骤程序

1.

通过细胞计数和所需的冷冻培养基体积确定活细胞总数。

2.

离心细胞悬液。离心速度和持续时间会因细胞类型而异。

3.

不干扰沉淀的情况下,将上清液倒入废物中。

4.

根据特定细胞类型建议的活细胞密度,将沉淀重悬于冷的冷冻培养基中。

5.

将细胞悬液分装到低温储存瓶中,清楚标明日期、细胞类型和传代号。

6.

在控制速率的冷冻设备中冷冻细胞,每分钟降低温度约1℃。或者,将含有细胞的冷冻管放在异丙醇室中,并在–80℃下储存过夜。

7.

将冷冻的细胞转移到液氮中,并在液氮上方的气相中进行存储。

*以尽可能高的浓度和尽可能低的传代数冷冻培养的细胞。冷冻之前,请确保至少有90%的细胞能够存活。始终使用无菌冷冻管保存冷冻细胞。始终使用适当的无菌技术,并在层流罩中工作。

安全注意事项:使用DMSO时应格外小心,因其会促进有机分子进入组织。处理该试剂时,请戴手套并穿着适当的防护服。按照当地法规处理试剂。


2.10 解冻冷冻细胞

解冻细胞对冷冻细胞的压力极高,因此与冷冻细胞应缓慢进行冷冻不同,解冻细胞应尽可能快地进行,以确保细胞的高存活率。

解冻细胞方案

步骤程序

1.

小心从液氮中取出细胞

2.

立即迅速解冻冷冻的细胞

3.

冰融化后,转移到层流罩中。

4.

将已解冻的细胞逐滴转移到装有所需已预热培养基的离心管中。

5.

离心细胞悬液。离心速度和持续时间会因细胞类型而异。

6.

离心后,除去上清液并搅动沉淀。

7.

小心地重悬于新鲜培养基中,并转移至合适的烧瓶大小并进行孵育。


2.11 支原体检测

细胞培养实验室中最常见的污染物之一是支原体。支原体是一种缺乏细胞壁的基本细菌,被认为是最小的自我复制生物。由于支原体的尺寸很小(大约> 1µm),因此很难检测到,直到达到极高的密度并导致细胞培养物变质才会知道它们的存在。

许多生长缓慢的支原体可以在未检测到的培养物中持续存在而不会引起细胞死亡,但是,它们可以改变培养物中宿主细胞的行为和代谢。慢性支原体感染也可能导致悬浮培养物中细胞增殖速率降低,饱和密度降低和凝集。检测此类支原体感染的方法是定期检测细胞培养物;荧光染色(例如Hoechst)、ELISA、PCR、免疫染色、放射自显影或微生物测定。

2.11.1 使用抗生素

应谨慎使用细胞培养中的抗生素。连续使用抗生素会增强抗生素耐药性,允许存在低水平的污染并掩盖各种污染物。一些抗生素还可以与细胞发生交叉反应并干扰正在研究的细胞过程。

3. 细胞培养设备

细胞培养实验室根据研究机构和研究领域的不同而有很大差异。但是,所有细胞培养实验室确实都具有一些的通用设备和要求,其中最重要的是保持无菌的病原体环境。以下是可在更多细胞培养实验室中使用的常见设备和材料的列表。此列表并不完整,根据研究领域的不同可见其中的偏差。

基本设备

细胞培养实验室根据研究机构和研究领域的不同而有很大差异。但是,所有细胞培养实验室确实都具有一些的通用设备和要求,其中最重要的是保持无菌的病原体环境。以下是可在更多细胞培养实验室中使用的常见设备和材料的列表。此列表并不完整,根据研究领域的不同可见其中的偏差。

  • 细胞培养罩(即层流罩或生物安全柜)
  • 保温箱(建议使用潮湿的CO2保温箱)
  • 水浴
  • 离心机
  • 冰箱和冰柜(–20℃)
  • 细胞计数器(自动细胞计数器或血细胞计数器)
  • 倒置显微镜
  • 液氮(N2)冰箱或冷冻储藏容器
  • 细胞培养容器(例如烧瓶、培养皿、滚瓶、多孔板)
  • 移液器
  • 注射器和针头
  • 垃圾箱
  • 培养基、血清和试剂
  • 细胞
 
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