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Macrophages巨噬细胞的体外极化诱导

发布时间:2022-06-11   点击次数:114次

巨噬细胞是造血系统中最具可塑性的细胞,存在于所有组织中,具有丰富的功能多样性。巨噬细胞参与细胞碎片和病原体的识别、吞噬和降解,并且在向T细胞提呈抗原以及诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分子等方面发挥作用,从而启动适应性免疫反应。

除此之外,巨噬细胞还在维持组织稳态以及组织的修复和重塑方面发挥作用。当遇到不同的抗原刺激时,单核细胞会变成高度杀伤性的巨噬细胞(M1),或变成免疫抑制性的巨噬细胞(M2)。

巨噬细胞极化.jpg

实验前准备

耗材准备试剂准备
1、细胞培养板/皿2、细胞计数仪3、移液枪、枪头1. 细胞诱导因子 2. 消化酶3. 无菌PBS4. 培养基、血清5. 流式抗体


一、THP-1细胞的极化

1) THP-1细胞铺板,将佛波酯PMA(100 ng/ml)加入完全培养基中,诱导其向巨噬细胞的成熟;

2) 48小时后THP-1细胞成熟为巨噬细胞,外观圆形高折光,从悬浮状态快速变成贴壁状态;

3) 将成熟的巨噬细胞消化下来(Accutase酶消化:专门用于消化贴壁细胞),重新铺板,诱导向M1-like、M2-like的极化。

4) 与IFN-γ(20 ng/ml)和LPS(100 ng/ml)孵育48小时以上,使其向M1极化。

与IL-4(20 ng/ml)和IL-13(20 ng/ml)孵育48小时以上,使其向M2极化。

5) 极化完成后,细胞用不含刺激物的无血清RPMI重悬,可保持72小时。


二、单核细胞来源巨噬MDM

1) 将单核细胞以5×105/ml的浓度接种在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中,同时加入20 nM的CSF-1。

2) 单个核细胞在37°C、5% CO2条件下培养7天,每3天更换一次培养液,获得MDM。

3) MDM得到之后,去除原培养基,更换新的培养基。

4) 若与新鲜的、无血清的RPMI继续培养,则维持M0状态。

5) 与LPS(1 μg/ml)和IFN-γ(10 ng/ml)孵育48小时,则向M1极化。

与IL-4(20 ng/ml)和IL-13(5 ng/ml)孵育48小时,则向M2表型极化。

6) 极化完成后,细胞用不含刺激物的无血清RPMI重悬,可保持72小时。


三、骨髓来源巨噬细胞BMDM

1) 将分离的骨髓细胞以2×106/ml的浓度接种在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的IMDM培养基中,同时加入10 ng/ml M-CSF。

2) 在第3天更换新鲜的BMDM生长培养基。

3) 第7天,荧光团偶联抗体染色,用流式细胞术检测表达CD11b和F4/80的细胞来评估成熟BMDM的形成。

4) 第7天,成熟BMDM的形成后改为新鲜刺激培养基。

5) 与100 ng/ml LPS或含有50 ng/ml IFNγ的100 ng/ml LPS共孵育,则向M1极化。

与10 ng/ml IL-4和/或10 ng/ml IL-13共孵育,则向M2极化。

6) 用0.05%的胰蛋白酶将受刺激的细胞从培养皿中分离出来,然后用含有10%胎牛血清的PBS洗涤细胞两次。


四、RAW264.7细胞极化

1) 将RAW264.7细胞重悬在含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中。

2) 将传至2-5代的细胞作为后续实验使用。

3) 并将培养基换成不含胎牛血清的完全培养基。

4) 与100 ng/ml LPS共孵育,则向M1极化。

与20 ng/ml IL-4(可添加20 ng/ml IL-10)共孵育,则向M2极化。


下表为对以上4种细胞诱导试剂进行的简要汇总

细胞培养基初始加入
THP-1细胞RPMI 1640100ng/ml PMA
单核细胞来源巨噬MDMRPMI 164020 nM CSF-1
骨髓来源巨噬细胞BMDMIMDM10ng/ml M-CSF
RAW264.7细胞DMEM/
M1极化M2极化
20ng/ml IFN-γ100ng/ml LPS20 ng/ml IL-420 ng/ml IL-13
1μg/ml LPS10ng/ml IFN-γ20 ng/ml IL-45 ng/ml IL-13
100ng/ml LPS(可加50 ng/ml IFNγ)10 ng/ml IL-4(可加10 ng/ml IL-13)
100ng/ml LPS20ng/ml IL-4(可加20ng/ml IL-10)


参考文献:

[1] Saqib U, Sarkar S, Suk K, Mohammad O, Baig MS, Savai R. Phytochemicals as modulators of M1-M2 macrophages in inflammation. Oncotarget. 2018 Apr 3;9(25):17937-17950.

[2] Mohammad NS, Nazli R, Zafar H, Fatima S. Effects of lipid based Multiple Micronutrients Supplement on the birth outcome of underweight pre-eclamptic women: A randomized clinical trial. Pak J Med Sci. 2022 Jan-Feb;38(1):219-226.

[3] Tedesco S, De Majo F, Kim J, Trenti A, Trevisi L, Fadini GP, Bolego C, Zandstra PW, Cignarella A, Vitiello L. Convenience versus Biological Significance: Are PMA-Differentiated THP-1 Cells a Reliable Substitute for Blood-Derived Macrophages When Studying in Vitro Polarization? Front Pharmacol. 2018 Feb 22;9:71.

[4] Ying W, Cheruku PS, Bazer FW, Safe SH, Zhou B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. 2013 Jun 23;(76):50323.

[5] Kimbrough D, Wang SH, Wright LH, Mani SK, Kasiganesan H, LaRue AC, Cheng Q, Nadig SN, Atkinson C, Menick DR. HDAC inhibition helps post-MI healing by modulating macrophage polarization. J Mol Cell Cardiol. 2018 Jun;119:51-63.

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