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悬浮细胞如何固定做免疫荧光?

更新时间:2023-11-29   点击次数:834次

悬浮细胞总是在孵抗体和洗的时候被冲掉,悬浮细胞做免疫荧光怎么固定?


传统方法

实验步骤:

1. 细胞在冰浴中冷却,然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min,吸去培养液并以4℃PBS重悬细胞。

2. 离心吸去PBS,以1~2 ml 2%PFA固定液,或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重悬细胞,置冰上固定30 min。

3. 离心、吸去固定液,用15 ml 4℃ PBS重悬细胞,放5 min 后,用PBS再次洗涤细胞。

4. 稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min,250 μl 抗体足够用于5x106细胞。

5. 离心细胞,吸去PBS,重悬细胞于第一抗体中,置4℃温育1 h。

6. 用4℃ PBS稀释细胞和抗体至15 ml。

7. 离心,吸去PBS,以4℃ PBS重悬细胞,重复1次。

8. 第二抗体4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min,5x106细胞用250 ul 抗体足够。

9. 吸去PBS,以第二抗体重悬细胞,4℃温育1 h,重复步骤6及步骤7。

10. 除非立即观察细胞,否则在进行细胞浓缩的下一步操作之前应以铝萡包裹离心管并冷藏。

11. 离心细胞并以少量PBS重悬(勿用水),将细胞悬液滴于多聚-L-赖氨酸覆层的载玻片上,加上盖玻片,尽可能马上观察结果。 

镜下观察:没有细胞,原来掉片了!!!

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