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小鼠脾脏细胞分离方法

更新时间:2024-05-22   点击次数:134次

脾脏处理

1.将两个已解剖分离的脾脏,置于一个15 mL离心管顶部配备的70 μm细胞筛网上。使用无菌注射器的柱塞,以温和力度将脾组织压碎以通过细胞筛网进行匀浆处理,确保不破坏细胞结构。在整个过程中,分次使用总计6 -10mL的含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基,逐步冲洗筛网以收集细胞。2.将收集到的细胞悬液以500 × g离心5分钟,随后,小心地去除上清液,并将细胞沉淀重悬于5 mL的红细胞裂解缓冲液中,在室温下静置孵育5分钟。孵育结束后,迅速加入10 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)以终止红裂过程,再次以500 × g离心5分钟。若沉淀中仍有残留红细胞,需重复上述裂解和洗涤步骤,直至肉眼所见无红色。3.细胞计数与活力检测:完成裂解后,以500 × g离心5分钟,丢弃上清液,然后将细胞沉淀用1 mL PBS重新悬浮。接下来,采用台盼蓝排除法鉴别活细胞,在血细胞计数板上进行精确的细胞计数,以确定活细胞的数量。这种方法基于台盼蓝无法穿透活细胞膜而能够染色死细胞的原理,从而区分出活细胞和死细胞的比例及总数。4. 通过流式检测抗体标记的脾脏细胞。尤其需要注意一点,对于脾脏巨噬细胞的流式检测,在抗体标记前,需要Fc受体的封闭,避免非特异染色。5. 大家拿到自己的流式结果后,如果实验结果不符合自己的预期。这时最需要做的就是质控自己的流式数据,比如细胞的分群,大概比例,细胞的死活,细胞的数量,分群是不是集中,一定要找文献,无论如何,对照组的正常小鼠,这个数据是可以参考的。如果自己的流式数据对着文献都不太符合常规,就不要给给实验下结论。这时,基础的实验体系就有问题。

小鼠脾脏细胞分离方法

小鼠脾脏细胞分离方法

6. 对于巨噬细胞,CD11b和F4/80双标,肝脏和脾脏,还有腹腔,肯定会有三群(根据这两个maker的表达高低)。对于很多用荷兰liposoma品牌的巨噬细胞清除剂clodronateliposomes氯膦酸二钠脂质体的客户来说,清除组和对照组,也可以参考这个图。


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