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Covaris 超声打断技术助力FFPE样本蛋白质组学

更新时间:2024-05-24   点击次数:140次

FFPE样本,即福尔马林固定石蜡包埋组织样本。在临床研究中组织离体后,其原有的形态功能很难完整地保存,因此通过甲醛固定以及石蜡包埋的方式可以最大限度地保存样本的完整性以及生物大分子的完整性,因此FFPE样本也成为了临床蛋白质组学研究的宝贵资源。但是目前FFPE样本蛋白组学样本制备仍存在着标准化程度低、效率低、重复性低和扩展性差等问题,靶点科技给您介绍一种FFPE样本蛋白组学样本制备新方法 ---Covaris 自动声波聚焦技术。


Covaris AFA聚焦超声+S-Trap 方法-FFPE样本蛋白提取新方法

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近期,Dylan M. Marchione等人在Journal of Proteome Research上发表了题为“HYPERsol: High-Quality Data from Archival FFPE Tissue for Clinical Proteomics"的文章,该文章报道了一种高产蛋白质提取和直接溶解回收的方法-HYPERsol,是一种Covaris AFA超声和S-Trap样品处理的优化工作流程,能够使FFPE样品的蛋白质组覆盖率和量化程度达到与新鲜冰冻组织相当的水平。

FFPE样品蛋白质提取的工作流程分为三个基本步骤:提取、组织均质化和蛋白质回收。评估了两种可选择的组织提取策略:二甲苯-乙醇脱蜡(用 "X "表示),直接溶解于5%的SDS水溶液(用 "D "表示);比较了两种均质化技术:探针超声处理(用 "P "表示)和AFA超声处理(用 "U "表示);比较了两种下游分析的蛋白质回收技术:甲醇-氯仿沉淀(以 "M "命名)和S-Trap样品处理(以 "S "命名)。进行多种处理组合实验(图1)。
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图1. 多种处理组合实验表。FFPE处理,传统:二甲苯-乙醇,探头,甲醇-氯仿;HYPERsol:SDS溶解,AFA超声,S-Trap。新鲜冰冻处理,FPS:冰冻,探头,S-Trap;FUS:冰冻,超声,S-Trap。




Covaris AFA聚焦超声+S-Trap 方法提高了FFPE样品的覆盖深度

      首先,作者用质谱检测了多种处理组合的人类肝脏样品,发现相较于传统(“XPM")的FFPE样品处理,HYPERsol (“DUS")的结果是多识别11211种(37%)肽类和644种(24%)蛋白质组,接近于新鲜冰冻样品检测深度(“FPS")。相较于传统工作流程,DPS和HYPERsol的平均蛋白质序列覆盖率均有显著提高,从20.0%到23.9%(图2)。

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图2. 相较于传统的工作流程,HYPERsol提高了FFPE样本的蛋白覆盖深度。a 新鲜肝脏样品被制作成新鲜冰冻样品或FFPE样品。b 实验条件表。c、d 不同条件下的肽类和蛋白质组数量鉴定。e 不同条件下蛋白质序列覆盖率的密度图。星号:与FPS相比;n = 3;* :p < 0.05,** :p < 0.01,*** :p < 0.001。




Covaris AFA聚焦超声+S-Trap 方法提取FFPE蛋白质与新鲜冰冻组织相媲美

      接下来,作者评估了FFPE样本中提取的蛋白质与冰冻组织中提取的蛋白质的差异程度。蛋白质组数据集的皮尔逊相关系数显示,HYPERsol(FFPE)数据集与FUS(冰冻)数据集非常相似,平均相关系数达0.936,显著高于传统方法与FUS相似性(0.852)。火山图表明,“HYPERsol与FUS处理"的蛋白质组的相对丰度差异显著小于“传统和FUS处理"蛋白质组的相对丰度差异,HYPERsol法处理FFPE样本更能真实还原原始组织的组成(图3)。总体而言,利用HYPERsol法从FFPE样本中提取蛋白质与从冰冻组织中提取蛋白质的水平相媲美!


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图3. HYPERsol产生的蛋白质组学数据与新鲜冰冻组织相似。b、c不同条件下肽类和蛋白质组的数量鉴定。n = 3;星号:与HYPERsol相比;* :p < 0.05,** :p < 0.01,*** :p < 0.001。d 散点图描述了每个实验条件的蛋白质组数据与FUS数据之间的相关性,R值:皮尔逊相关系数。e 相关矩阵描述了所有成对运行比较中的皮尔逊相关系数。f、g 火山图比较了传统和FUS条件下、HYPERsol和FUS条件下检测到的蛋白质的相对丰度差异。




FFPE存档样本蛋白质组学鉴定成为可能

      以上,作者证实了HYPERsol法在FFPE样本的蛋白质提取中占据重要优势。此外,作者对以往难以诊断的恶性外周神经鞘膜瘤(MPNST),以及与其难以区分的黑色素瘤和滑膜肉瘤进行分析,发现HYPERsol法特别适合于鉴定新的免疫组织化学(IHC)标记,以促进组织形态学非特异的肿瘤诊断。


作者利用HYPERsol法提取32个存档的FFPE肿瘤样本,质谱分析共鉴定到6123个蛋白质组,分析显示,近90%在3种肿瘤中均被检测到,数字统计上表现出鉴定标志物区分类似肿瘤的困难,当然每类肿瘤中也均检测到特异性的蛋白质,这些蛋白质与已知的蛋白质表达特征基本一致。
研究还发现了其余几种肿瘤类型特异性的蛋白质(MPNST中有103种,黑色素瘤中有114种,滑膜肉瘤中有43种),其中包括已知的黑色素瘤标志物酪氨酸酶,仅在黑色素瘤(9/10)中被检测到,以及ICAM5蛋白仅在滑膜肉瘤(9/9)中检测到,其他肿瘤中未被检测到,新发现的这些标志物,有望作为诊断中具有挑战性肿瘤的有效IHC标记(图4)!


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图4. HYPERsol使FFPE存档组织样本的蛋白质组学鉴定成为可能。a−c 恶性外周神经鞘膜瘤、黑色素瘤和滑膜肉瘤的H&E染色。d 3种肿瘤类型中识别的蛋白质组数箱图。e 3种肿瘤类型之间检测到的蛋白质重叠维恩图。f 散点图,描绘标本的储存期与已确定的蛋白质组数之间的关系。虚线表示具有95%可信区间的最佳拟合线;R值和P值基于皮尔逊与乘积矩相关性。g、h MPNST和黑色素瘤、黑色素瘤和滑膜肉瘤中差异蛋白表达的火山图。I-k TYR、TLE1和ICAM5在3种肿瘤中的丰度表达。* : p<0.001,** :  p<0.0001。


总结



HYPERsol法对FFPE组织进行高度可重复的蛋白质提取,将蛋白提取结果提升至新鲜冰冻组织的水平。该法先将样品直接溶于SDS中,避免了去石蜡化的需要,从而提高了样品的产量;后通过Covaris S220 聚焦超声处理,裂解组织样品,充分释放蛋白质,保护其生物大分子活性不被破坏,同时也消除了样品与超声处理探针接触而造成交叉污染的可能性;最后,使用S-Traps进行蛋白质回收和下游样品制备远优于用甲醇-氯仿沉淀,因其不需要沉淀和溶解蛋白质。这种结合Covaris AFA超声处理的新颖方法,能更好的裂解组织细胞,释放丰富的蛋白种类及数量,更加释放了科学研究的无限可能!


随着Covaris AFA超声处理和S-Trap样品处理的96孔板的出现,HYPERsol将适用于临床标本的自动化、高通量分析。HYPERsol工作流程有望使丰富的临床注释和组织学特征的FFPE生物库中的新发现成为可能,从而帮助开创一个临床蛋白质组学的新时代!


参考文献:Dylan M. Marchione, et al. HYPERsol: High-Quality Data from Archival FFPE Tissue for Clinical Proteomics. J. Proteome Res. 2020, 19(2): 973-983.

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