一、实验概述及试剂准备
细胞免疫荧光实验通过特异性抗体与细胞内相应抗原结合，再利用荧光标记的二抗进行检测，从而实现对细胞内蛋白的可视化。这一技术在细胞结构与
功能研究、疾病机制探索等方面具有重要应用。
1. 抗体选择
一抗需特异性识别目标蛋白，荧光二抗则要与一抗来源动物种属相匹配。例如，如果一抗是小鼠来源，二抗需是抗小鼠的荧光抗体。
2. 固定剂与破膜剂
4% 多聚甲醛用于固定细胞，保持细胞结构。曲拉通（破膜剂）用于通透细胞膜，使抗体能够进入细胞内与抗原结合，但对于膜蛋白染色则可能不需要
此步骤。
3. 封闭试剂
BSA（牛血清白蛋白）或二抗来源动物的血清（如山羊血清）用于封闭非特异性结合位点，减少背景荧光。
4. 其他试剂
PBS 用于清洗细胞，DAPI 用于染细胞核，抗荧光淬灭封片剂用于封片并防止荧光淬灭，可选用含 DAPI 的封片剂简化操作。
5.玻片选择
-贴壁细胞：可使用盖玻片或专用细胞爬片，还有共聚焦小皿可供选择。不同规格的共聚焦培养皿（如圆形的 φ24mm、φ20mm、φ14mm、φ8mm）分别对应不
同孔板配套用细胞爬片。
-悬浮细胞：直接使用靶点科技悬浮细胞免疫荧光专用玻片（Biotarget）。不要再用传统的方法，否则掉片不可避免。
二、细胞爬片准备及操作
1.爬片处理（非共聚焦小皿）
将剪裁好的爬片或购买的成品爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，然后用自来水冲洗干净。接着将其置于消毒饭盒中，饭盒底面放纱布，玻片斜靠在饭盒侧
壁且正面不接触纱布，进行高压蒸汽灭菌后烘干。
对于原代细胞或贴壁不牢的细胞，爬片前最好用多聚赖氨酸、层粘蛋白或胶原溶液处理玻片以增加细胞粘附性，处理后用培养基冲洗 1 - 3 遍再放入培
养基中。
2.共聚焦小皿
无需前处理操作，直接在超净台打开包装，加入细胞悬液，盖上皿盖，置于培养箱中培养即可。
三、实验操作
1.细胞接种准备
胰酶消化细胞后计数，重悬细胞于培养基中。根据玻片大小，在每个孔里放爬片的位置先滴 100ul 培养基，使玻片与培养皿靠培养基张力粘合，然后放
玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起。
2.细胞接种
根据实验需要及细胞生长情况选择合适的细胞密度接入培养板内。待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
3.玻片取出
按照实验设计，作用一定时间后取玻片（通常作用 24h）。取玻片时，可将注射器针头针尖向背面弄个小钩，轻轻勾起爬片，用小镊子取出。对于多时
间点实验，取出所需数量的爬片时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子，未取出的可接着继续培养。
四、固定、通透及封闭步骤
1.清洗与固定方式
可以将爬片取出用 PBS 清洗后固定，也可以直接在孔板中清洗并固定。共聚焦小皿则直接移除培养基，加入 PBS 清洗 1 - 3 次（不可剧烈摇晃），然后
加入 4% 多聚甲醛进行固定，通常在室温（RT）固定 15 - 20min。
2.通透及封闭剂选择与作用条件
如果抗体针对胞内蛋白，则需要通透步骤。常用的透化剂是 0.1% Triton X - 100（将 100% 的成品用 PBS 稀释），作用 10min，但文献中也有用 0.2% 或 0.5% Triton X - 100 的，具体可根据预实验进行调整。
BSA 浓度为 1% 或 5%（用 PBS 溶解），血清浓度为 10%，在室温（RT）封闭 30min。如果一抗结合力很强或二抗有非特异性结合，可添加 0.1% Tween20。
五、抗体孵育及染色封片
1.一抗稀释与孵育条件
封闭结束后，用 PBS 清洗 3 遍，然后孵育一抗。一抗可用封闭液稀释，也可以用 PBS 或抗体稀释液，在 4℃孵育过夜。一抗稀释比例可参照抗体说明书，建议从推荐比例中间开始试。
2.二抗孵育操作
次日吸走一抗（可回收）后，用 PBST 清洗 3 遍，每次 5 - 10min，然后避光孵育二抗 1h。
3.DAPI 染色操作
去除二抗，用 PBS 清洗三次，加入 DAPI，室温静置 5min，去除 DAPI，再用 PBS 洗 3 次。
4.封片操作
向载玻片上加入一滴封片剂，将盖玻片缓慢扣在载玻片上，细胞所在面靠近载玻片，用吸水纸吸除多余封片剂。
免疫荧光，其实各种Protocol大同小异，核心除了多联系，还要多思考。弄懂背后的逻辑。不能机械的做。
