多色流式细胞术和细胞分选是研究肝巨噬细胞（hepatic mϕ）的强大免疫学工具，但对于制备肝匀浆以进行这些分析的方法尚无共识。利用巨噬细胞和内皮细胞报告小鼠的组合、流式细胞术和共聚焦成像，我们已经表明，用于识别库普弗细胞（Kupffer cells, KCs）的常规流式细胞策略会包括相当比例的CD31高表达肝窦内皮细胞（LSECs）。无论为流式细胞术制备细胞的方法如何，这些内皮细胞均存在，并且代表紧密附着在KC膜残余上的内皮。针对内皮标志物（如CD31）的抗体对于排除这些细胞至关重要。这一结果将人们的注意力集中在最近发布的微阵列数据集中，这些数据集显示与其他组织驻留巨噬细胞相比，KCs高表达与内皮细胞相关的基因。我们的研究还揭示了常用分离方法中KCs在白细胞中显著且特异性的丢失，这些方法导致增殖性和单核细胞来源的巨噬细胞被富集。因此，我们提出了一种方法，可以高产率地获得肝髓系细胞，而不会产生细胞类型偏倚或被内皮细胞污染。消除内皮细胞污染及传统肝库普弗细胞分离和分析方法中固有的选择偏倚的实验方案。
爱丁堡大学Stephen Jenkins团队用Cdh5-CreERT2 × mTmG报告小鼠。 他们发现：在肝组织流式分析中，肝脏KF细胞经典的“F4/80高、CD11b低"设门群体中，有10%左右的细胞是CD31高表达的肝窦内皮细胞（LSECs）。这些细胞看似巨噬细胞，却在显微镜下露出真面目—— CD45⁺F4/80⁺CD31⁺的“双阳"细胞，实为Kupffer细胞残膜紧贴在内皮表面形成的粘连体（doublets）！
肝脏灌注，酶消化裂解。常用的分离方法是Percoll密度梯度离心法。无论那种方法，包括300g双离心法和50g慢速预离心法，都能在KCs群中看到“伪Kupffer细胞"——即CD31⁺污染。 而且，Percoll法虽然被广泛使用，却带来了相对更严重的细胞丢失和比例偏倚。Percoll法获得的Kupffer细胞数比300g法少7倍以上；Ki67阳性比例、骨髓嵌合结果均被高估。因此，建议排除CD31⁺污染。肝脏库弗巨噬细胞流式检测受到内皮细胞干扰F4/80和CD31双阳。
