肺部含有多种巨噬细胞和树突状细胞群体，它们在肺部疾病中起着关键作用。准确识别和计数这些亚群对于理解它们在肺部疾病中的作用至关重要。流式细胞术是研究免疫系统的主流工具。然而，尚未有系统的流式细胞学方法能够在正常小鼠肺中准确且一致地识别巨噬细胞和树突状细胞（DC）亚群。在本研究中，我们开发了一套表面标志物Panel和分析策略，能够准确识别肺中稳态条件下所有已知巨噬细胞和树突状细胞群体及其前体细胞。
肺脏包含多种固有免疫细胞：
肺脏样品制备：
肺组织处理：
• 经右心室灌注PBS后，剪碎肺组织，用胶原酶D（1 mg/mL）和DNA酶I（0.1 mg/mL）消化。
• 过40 μm尼龙筛，制备单细胞悬液，裂解红细胞。
• 台盼蓝染色排除死细胞，用细胞计数仪计数。
肺脏稳态条件下圈门策略：
圈门步骤：
表面Marker：
• 单核/未分化巨噬细胞：CD11b⁺ CD11c^(±) MHC II⁻ CD64^(low) Ly6C^(hi/lo)
为验证准确性，对各群细胞进行了分选并做细胞涂片（Diff-Quik染色）：
• AM：伪足明显，胞质含空泡
• DC和IM：核不规则，胞质多空泡
肺泡巨噬细胞自发荧光强，易导致假阳性，本组合通过多参数交叉验证避免误判，克服了自发荧光干扰。CD11b⁺ DC vs 间质巨噬细胞，区别的关键在于 CD64⁺ vs CD24⁺，区分易混细胞群体。相比之下，传统“CD11b vs CD11c"双参数设门法无法区分CD11b⁺ DC、间质巨噬细胞和未成熟单核细胞，且易将中性粒/嗜酸粒误判为单核细胞。因此，这篇文献，系统的给小鼠肺脏巨噬细胞和DC细胞文献参考圈门解决方案。
原始文献：
Misharin AV, Morales-Nebreda L, Mutlu GM, Budinger GR, Perlman H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013;49(4):503-510. doi:10.1165/rcmb.2013-0086MA
