腺病毒载体是基因治疗临床试验中常用的递送工具，同时在肿瘤治疗中，作为疫苗载体与溶瘤制剂也具备巨大应用潜力。其优势在于可制备得到高滴度病毒，基因组易于改造，并且能够在多种分裂与非分裂细胞中驱动高水平的转基因表达。
尽管拥有上述优良特性，但人群中普遍存在的预存免疫，限制了腺病毒载体的大规模应用。绝大多数腺病毒载体基于5 型腺病毒（Ad5）构建，该问题在 Ad5 上尤为突出。预存体液免疫会造成转基因表达水平低下；用于疫苗接种时，还会使机体针对靶抗原的 CD8⁺T 细胞应答减弱。因此，阐明抗 Ad5 抗体存在条件下，介导转基因表达抑制、激活免疫应答的分子机制，将为克服预存免疫难题提供新的研究思路。
绝大多数抗 Ad5 中和抗体（NAbs）靶向病毒主要外壳蛋白六邻体（hexon），更具体地说，是靶向其暴露于溶剂的高变区（HVR）。而 Ad5 依赖柯萨奇‑腺病毒受体（CAR）的入胞过程，由纤突蛋白与五邻体基底介导，六邻体并不参与该过程。由此说明，这种中和效应并非通过传统的阻断病毒入胞途径实现。
在灵长类与啮齿类动物体内，Ad5 可被多种细胞摄取，包括库普弗细胞与肝细胞。由于TRIM21几乎在所有组织中广泛表达，该分子可能在上述两种细胞中均参与免疫应答。初次给予 Ad5 载体时，单核‑吞噬系统会在病毒感染肝实质细胞之前将其清除。因此，本研究尝试在Ad5感染前用荷兰Liposoma巨噬细胞清除剂耗竭/清除巨噬细胞，以此区分巨噬细胞内 TRIM21 介导的中和作用与肝细胞内的中和效应。
为此，在注射 Ad5 之前，利用荷兰Liposoma氯膦酸脂质体ClodronateLiposomes耗竭库普弗细胞，并通过 Adgre1、Clec4f 标志物验证耗竭效果。经氯膦酸处理的小鼠对脂多糖（LPS）的应答水平下降，证实巨噬细胞功能被有效耗竭。PBS 脂质体处理虽不会影响巨噬细胞数量，但会轻微减弱炎症应答，因此后续实验仅采用 PBS 作为对照组。
氯膦酸盐脂质体ClodronateLiposomes清除肝脏巨噬细胞qPCR检测方案。
(A) 分别给予 PBS、PBS 脂质体、氯膦酸脂质体处理 48 h 后，小鼠肝脏中库普弗细胞标志物 Clec4f 与泛巨噬细胞标志物 Adgre1 的表达水平。
(B) 经 PBS、PBS 脂质体或氯膦酸脂质体处理的小鼠，注射 LPS 6 h 后肝脏细胞因子的诱导情况。每组小鼠样本量 n = 3。
Ad5 感染前 48 小时进行巨噬细胞耗竭处理，可提升转基因表达水平（图 1G），这与巨噬细胞能够清除病毒、限制转导效率的已知功能相吻合。该效应在病毒剂量为 10⁹的低剂量组中最为显著，氯膦酸处理小鼠的转基因表达提升 8 倍。该结果提示巨噬细胞优先摄取病毒；但高病毒剂量下巨噬细胞会达到摄取饱和，从而使肝细胞发生有效转导。该发现与既往文献报道的小鼠 Ad5 剂量‑反应非线性关系一致：先给药会使库普弗细胞饱和，第二次给药时更多病毒颗粒便可有效感染肝细胞（28）。
在给予野生型 rh9C12 抗体的条件下对小鼠注射 Ad5‑Luc，PBS 组与氯膦酸处理组小鼠的转基因表达均显著下降（图 1H）。两种处理条件下该抑制效应均高度依赖 TRIM21，说明 TRIM21 能够直接在肝细胞中高效阻断基因递送，该过程不依赖巨噬细胞的中和作用。
图1.抗 Ad5 抗体介导的转基因表达下调依赖 TRIM21。(A) 感染后不同时间点的病毒拷贝数。(B) 人 IgG1 结构模式图。参与结合 Fcγ 受体的关键残基标为红色（L234/L235）；TRIM21 与 FcRn 结合位点标为蓝色（H433 为浅蓝，N434、H435 为深蓝）。(C) 在野生型小鼠体内，分别给予 2.5 μg 野生型 rh9C12 抗体、FcγR 结合缺陷突变体 LALA，检测 Ad5‑Luc 在肝脏中的相对感染水平。(D) 使用 1 μg 野生型 rh9C12 抗体、TRIM21 结合缺陷突变体 H433A，检测 Ad5‑Luc 在野生型与 T21‑KO 小鼠肝脏（左）、脾脏（右）中的相对感染水平。(E) 使用 1:500 稀释的抗 Ad5 免疫血清处理，感染 4 h 后的病毒拷贝数。(F) 使用不同稀释比例的抗 Ad5 免疫血清，检测 Ad5‑Luc 在野生型与 T21‑KO 小鼠肝脏中的相对感染水平。(G) 氯膦酸处理组与对照组小鼠中，以相对光单位（RLU）检测得到的绝对感染水平。(H) 使用 1 μg 野生型 rh9C12 抗体、TRIM21 结合缺陷突变体 H433A，检测氯膦酸处理组与对照组小鼠体内的相对感染水平。误差棒代表平均值 ± 标准误（mean ± SEM）；每组小鼠样本量 n = 3‑10。
论文信息：
论文题目：TRIM21 mediates antibody inhibition of adenovirus-based gene delivery and vaccination
期刊名称：PNAS
时间期卷：115 (41) 10440-10445
Doi.org/10.1073/pnas.1806314115
产品信息：
货号：CP-010-010
规格：10ml+10ml
品牌：Liposoma
产地：荷兰
名称：Clodronate Liposomes&Control Liposomes
办事处：靶点科技
Clodronate Liposomes氯膦酸盐脂质体清除腺病毒递送小鼠肝脏巨噬细胞。荷兰Liposoma巨噬细胞清除剂ClodronateLiposomes见刊于PNAS：TRIM21介导抗体对基于腺病毒的基因递送和疫苗接种的抑制作用。
Liposoma巨噬细胞清除剂Clodronate Liposomes氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞的材料和方法：
In vivo macrophage depletion
Liver Macrophage Depletion.
巨噬细胞清除材料和方法文献截图：
