由于地表型脂鲤在损伤修复后期，体内持续存在功能特化的免疫细胞，我们进一步探究了该阶段巨噬细胞的功能。在地塞米松处理后，对 14 dpci 地表型脂鲤心脏中的 c1qa⁺巨噬细胞进行定量统计，结果显示给药组与对照组心脏的 c1qa⁺细胞数量无显著差异（图 4a、补充图 3a），提示修复后期巨噬细胞的持续存留并不依赖广谱炎症信号调控。对 7 dpci 与 14 dpci 地表型脂鲤巨噬细胞的高表达标志基因开展基因本体（GO）富集分析，结果显示溶酶体通路是修复后期排靠前的激活通路，同时细胞迁移、胞吞相关通路也显著富集（图 4b）。考虑到瘢痕组织大约从 7 dpci 开始肉眼可见地消退，我们继而验证这些巨噬细胞是否具备活跃的吞噬功能。自 7 dpci 至 14 dpci，向地表型脂鲤注射 DiI 荧光标记的 PBS 脂质体，并于 14 dpci 摘取心脏。绝大多数 c1qa⁺巨噬细胞摄取了 DiI 脂质体（补充图 3c、d），证实这类细胞在损伤修复后期具备活跃的吞噬能力。
为明确吞噬型巨噬细胞的功能意义，我们在 7 dpci 至 14 dpci 使用氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞（图 4c）。氯膦酸二钠脂质体被吞噬细胞摄取后可诱导细胞凋亡，从而特异性清除巨噬细胞。与 DiI-PBS 脂质体对照组相比，氯膦酸二钠处理组损伤区域的 c1qa⁺巨噬细胞数量显著下降（图 4d、补充图 3b）。为验证氯膦酸二钠优先清除吞噬型巨噬细胞，我们将氯膦酸二钠脂质体与 DiI 脂质体共注射；结果显示，相较于 PBS 对照组，共注射组细胞对 DiI 脂质体的摄取水平显著降低（图 4e、f）。为验证吞噬功能是否参与瘢痕清除，我们在 14 dpci 对纤维化组织标志物心外膜转胶蛋白（TAGLN）进行定量检测。相较于 DiI-PBS 对照组，氯膦酸二钠单独处理组、氯膦酸二钠 + DiI PBS 共注射组心脏的心外膜 TAGLN 水平均显著升高（图 4g、h），说明吞噬型巨噬细胞缺失会造成瘢痕清除障碍。与之对应，30 dpci 时氯膦酸二钠处理组的损伤面积显著大于对照组（图 4i、j），证明修复后期的吞噬型巨噬细胞是心脏再生的必要条件。
此外，虽然 B 细胞在部分条件下也可表现出吞噬活性，但本研究仅观察到荧光信号与 c1qa 阳性细胞共定位，进一步说明该模型中巨噬细胞是主要的吞噬细胞。氯膦酸二钠处理不会改变损伤区域的 B 细胞数量（补充图 3h），提示巨噬细胞并非 B 细胞募集所必需。我们同时对csf1ra巨噬细胞缺失的 Panther 斑马鱼突变株进行 B 细胞计数，在 14 dpci 时，突变株 B 细胞数量与野生型对照组无差异（补充图 3i、j）。综上，心脏修复过程中 B 细胞的募集过程不依赖巨噬细胞。
为直接验证吞噬作用是否是后期巨噬细胞促进再生的核心机制，我们使用吞噬功能抑制剂 2 - 乙酰氨基酚（AMP）处理地表型脂鲤，并在 7 dpci 至 14 dpci 同步共注射 DiI 脂质体（图 4k）。AMP 处理不会减少损伤区域巨噬细胞的数量（图 4l），说明该药物特异性抑制吞噬功能，并不影响巨噬细胞存活。相较于对照组，AMP 处理组细胞摄取 DiI 脂质体的水平显著下降（图 4m、n），证实该药物可在体内有效抑制吞噬作用。与氯膦酸二钠实验结果一致，AMP 处理组心脏在 14 dpci 时心外膜 TAGLN 水平显著上升（图 4o、p），并且 30 dpci 的损伤面积明显更大（图 4r、s）。以上结果表明，吞噬作用是修复后期巨噬细胞介导心脏再生、清除瘢痕组织的核心机制。Clodronate Liposomes清除实验证实修复后期巨噬细胞是具备吞噬功能的活性细胞，为心脏再生所必需。
产品信息：
货号：CP-005-005
规格：5ml+5ml
品牌：Liposoma
产地：荷兰
名称：Clodronate Liposomes& Control Liposomes
现货：靶点科技
Clodronate Liposomes氯膦酸盐脂质体清除墨西哥洞穴鱼 Astyanax mexicanus中巨噬细胞 ，荷兰Liposoma巨噬细胞清除剂ClodronateLiposomes见刊于Nature Communications：持久性巨噬细胞和B细胞反应的缺失抑制了墨西哥洞穴鱼的心脏再生。
Liposoma巨噬细胞清除剂Clodronate Liposomes氯膦酸二钠脂质体清除肿瘤相关巨噬细胞的材料和方法：
Clodronate liposomes (5 mg Clodronate/mL) and Dil-fluorophore tagged control PBS liposomes (Liposoma, the Netherlands) were administered via intraperitoneal injection at 10 µL per fish between 7- and 14-dpci. Dil fluorescent PBS liposomes were injected from 7- to 11 dpci for 5 consecutive days to visualise affected cell populations. In a separate cohort, Clodronate and Dil-tagged PBS liposomes were mixed at 1:1 ratio and co-injected at 10 µL total per fish between 7- and 14-dpci to assess liposome uptake by targeted cell populations. Hearts were isolated at 14- and 30-dpci for RNAscope and immunostaining.
材料和方法文献截图：
