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悬浮细胞的培养细节及免疫荧光IF经验分享

更新时间:2023-06-04   点击次数:687次

细胞培养类型可以分为贴壁细胞和悬浮细胞两种,只有极少数类型细胞同时存在两种状态。

悬浮细胞是指不需要依赖支持物,可在培养基中以悬浮状态生长的一类细胞,如淋巴细胞和大部分血液系统来源细胞。(如小鼠白血病细胞WEHI-3, 人白血病细胞K-562, HL-60)。工业上也有越来越多的贴壁传代细胞被驯化出来,进行全悬浮的培养。目前在工业中应用的主要有SP2/0、NS0、CHO、BHK和HEK293细胞等,它们主要用于重组蛋白质生产;在兽用生物制品中常用的传代细胞主要有采用全悬浮培养的BHK21细胞、MDCK细胞;及借助微载体悬浮培养的Vero细胞、PK细胞、ST细胞、 Marc145细胞等,每种细胞的特性都不同。

一般情况下,悬浮细胞相较于贴壁细胞的处理更加简单一些,因为悬浮细胞传代时无须胰酶消化。但这并不意味着悬浮细胞比贴壁细胞好养,对新手来说,反而更具挑战性。总是会遇到各种各样的问题:比如,为什么总是出现死细胞和细胞分化;说好了传代很easy的,结果会出现分化;养好了冻存复苏后又出现问题了!


养好悬浮细胞,有如下大众经验分享。


要点一:足够的耐心,这是非常必要的

很多悬浮细胞在刚从冻存状态复苏时活力是相对较差的,此时我们需要有足够的耐心,等待细胞完成自我修复进入对数增长期。比如THP-1(人单核细胞白血病)从解冻到恢复正常增殖往往需要7-10天的恢复期;Jurkat,Clone E6-1(人T淋巴细胞白血病细胞)复苏后也需要5-7天才能恢复到冻存前的状态。新手可能会在此期间放弃培养,所以,请多一点耐心哦!培养这类细胞也是培养耐心的过程呢!

要点二:接种密度的把握

一般来说,悬浮细胞接种时密度不应低于50万个/ML,很多悬浮细胞有密度依赖,密度低导致的不增殖也是新手常见问题之一。当然,有极少数细胞在密度高时反而状态变差,如W6/32(小鼠B细胞杂交瘤细胞)。因此,培养不了解的细胞前查找相关资料去掌握细胞特性非常重要。


要点三:换液方法及频率

换液频率不应该被限制得“明明白白",细胞是活物,在一个连续培养周期内,视细胞生长状态可分多次添加补充培养基、葡萄糖等特定营养成份,维持细胞良好的生长状态。悬浮培养过程中,随着细胞的增殖,原有培养基中营养物质的消耗,代谢产物的增加,细胞的活率会下降,及时补充营养物质,使细胞处于一个相对良好的生存环境。切忌频繁离心换液。参考换液方法:

①离心全换液法

即通过离心(800-1000rpm,5min)去除全部旧的培养基,更换新鲜培养基。该方法适合“皮实“好养的悬浮细胞换液(如K562),或者当前细胞状态良好、密度较高导致培养基消耗较大的情况。此方法的优点是换液到位,能去除部分细胞碎片,但是同样会对细胞造成一定程度的机械损伤。

②离心半换液法

即通过离心(800-1000rpm,5min)50%细胞悬液,更换50%体积的新鲜培养基。该方法适合比较“矫情“难养的细胞(如thp-1),或者正在调整状态中、密度较低但碎片较多需要去除的情况。

③沉降换液法

即不使用离心机而是利用重力自然沉降的方法,将培养基与细胞分离,达到全部或部分更换新鲜培养基。但是其有应用局限性—只适合能成一定大小细胞团(否则无法自然沉降,只能低速离心)的细胞,尤其是处理依赖细胞聚集才能增殖的细胞时非常值得推荐,如NK-92、NK-92 MI、Jurkat。该方法能在换液过程中最大限度避免离心过程造成的机械损伤,同时保留聚集的细胞团,并且去除细胞碎片也较为干净。


固定悬浮细胞,有如下私房经验分享。


养好悬浮细胞,需要用化合物等试剂刺激悬浮细胞,或者共培养。使用免疫荧光来检查悬浮细胞,一直给很多新手,甚至高手造成心理阴影。如何固定好悬浮细胞?如何确保不掉片?甚至如何让悬浮细胞贴壁来做实验?是很多实验者的奢望。悬浮细胞固定/免疫荧光专用玻片给带来解决方案。


如下是一些悬浮细胞固定后做的免疫荧光图片,可以参考。



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