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肝脏细胞分类组成和肝脏巨噬细胞分离富集方案

更新时间:2024-06-15   点击次数:290次

1.肝脏细胞分类

肝脏是人体最大腺体,包含两大类细胞,分别是肝实质细胞(PC)肝非实质细胞(NPC)

肝脏实质细胞包括了肝细胞和胆管细胞。肝细胞约占所有肝细胞的70%,并负责大部分肝代谢功能。

肝非实质细胞约占总肝细胞的30%。肝非实质细胞包括巨噬细胞(Kupffer cells, KC)比例约35%、肝窦内皮细胞(Liver endothelial cells, LEC)比例约45%和肝成纤维细胞(Liver fibroblasts)。也就是说巨噬细胞和肝窦内皮细胞一起占据了80%。


肝脏细胞分类组成和肝脏巨噬细胞分离富集方案



2.肝脏内不同细胞分离富集

2.1肝组织灌洗:一方面可以去除肝细胞的红细胞,并通过胶原蛋白酶灌注提高肝组织的利用率,另一方面可以收集肝脏血液中的白细胞等其他免疫细胞。肝脏灌洗替代的方式可以将肝脏组织剪成2-4 毫米的小块,加入适量的酶并在最佳温度(通常为 37°C)下孵育适当的时间,间歇混合。最终将组织消化后通过筛网过滤细胞悬浮液。

2.2根据肝脏中各细胞的物理特性对肝内细胞进行分离和提纯。

例如由于粒径的差异,肝细胞的粒径普遍在100um左右,而KC、LEC、成纤维细胞的粒径普遍小于100um,因此可以40um或70um的细胞筛网筛去除不需要的肝细胞,也可以使用50g离心5min将肝细胞(会沉淀)和肝脏其他细胞(继续悬浮)分离开来。由于各细胞的密度差异,死细胞或细胞残渣由于密度小,在层析液中移动慢,因此使用不同密度梯度的层析液可以有效地分离死细胞和肝脏内各成分的活细胞。

2.3根据肝脏中各细胞的黏附速度进行分离

肝脏中KC与其他非实质细胞相比黏附速度很快,因此将肝脏非实质细胞提取放置在细胞培养箱中约30min,KC就会贴壁,而其他类型的细胞不会贴壁,此时吸走细胞培养基,留在培养瓶底的大多数为KC。反复操作可利于收集更多KC。

2.4根据肝脏细胞中各细胞的黏附能力进行分离

肝脏中成纤维细胞的黏附能力明显强于肝脏中其他细胞。因此如果细胞悬液中仅有成纤维细胞和目标细胞,例如LEC或KC等。可以使用胰酶短时间消化后立即收集细胞,反复多次操作利于提高目标细胞的比例。

2.5根据肝脏细胞中各细胞的生长速度辅助提纯

肝脏中成纤维细胞的生长能力很强,如果样本分离不纯使得目标细胞中掺杂了成纤维细胞,可以使用含1%FBS培养基限制成纤维细胞的生长,当细胞密度大于50%后,再通过胰酶快速消化的方法纯化目标细胞。


3.肝脏内不同细胞分离的器械、试剂或耗材

3.1 器械:准备镊子、刀片、留置针、50ml注射器/流泵(强烈建议用恒流泵)、外科线、外科剪、转运盒、冰块。

3.2 试剂:DMEM培养基、RPMI培养基、Hanks液、PBS、血清、肝细胞培养基(或购买地塞米松、胰岛素、白蛋白、谷氨酰胺等)、EDTA/肝素、双抗/三抗、胶原蛋白酶Ⅳ型、层析液Percoll、乙醇。

3.3 耗材:培养皿、培养瓶、细胞筛网、移液管、移液枪、50ml和15ml离心管。


4.肝脏灌注,密度梯度离心方法Intrahepatic macrophages isolation

Primary mouse macrophages were isolated from the mouse liver. Briefly, mouse livers were first perfused in situ with Ca2+ and Mg2+-free Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing 0.5 mM EGTA through the portal vein and then again with HBSS containing 0.05% collagenase IV. The digested livers were torn open and then gently separated with forceps until they were in suspension. The cell suspensions were filtered with a 70-μm cell filter, and the hepatocytes were removed by differential centrifugation (50×g, 5 min; 72×g, 5 min). To obtain nonparenchymal cells, the supernatant was collected and centrifuged further (300×g, 5 min; 650×g, 7 min). The pellets from both centrifugation steps were pooled and resuspended in DMEM containing 2% fetal bovine serum (FBS). The cell suspension was transferred to a 25%/50% Percoll gradient and centrifuged at 1200×g for 30 min without braking. The macrophage fraction was enriched in the interface between the 25% and 50% Percoll layers. Macrophages were purified by using a mouse F4/80 positive selection EasySep kit (EasySep™ Mouse F4/80 Positive Selection Kit; 100-0659) in accordance with the manufacturer’s instructions.


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