研究巨噬功能能时，我们经常用荷兰liposoma的巨细胞清除剂Clodronate Liposomes氨腾酸二钠脂质体(货号CP-005-005)清除体内巨噬细胞、然后回输修饰或者感兴趣的目的巨噬细胞。既要确保原位的巨噬细胞被很好的清除，又要让回输的巨细胞在早起阶段及时发挥作用且不能被巨细胞清除剂清除了。这种既要，又要，就要求注射清除剂后，合适的时间点回输目的细胞。鉴于回输实验比较难做，回输细胞的数量，活率，纯度以及功能性活性都决定了Transfer实验的成功与否。
回输的细胞类型：
WT和CD1d-KO小鼠。GM-CSF cultured bone-marrow derived cells (BMDCs) 骨髓来源GM-CSF培养刺激后的细胞
回输细胞的准备：
Generation of BMDCs and isolation of pMacs
Bone marrow cells were flushed from the femurs and tibias with cold PBS, filtered through a 45 μm strainer, pelleted by centrifugation and resuspended in complete RPMI media (Gibco; 10% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 14.3 μM β-Mercaptoethanol) supplemented with 20 ng/ml of GM-CSF (Biolegend). Medium was changed at days 3 and 4 of culture and cells were harvested on day 6. For stimulation experiments, CD11c+ cells were enriched by positive selection with CD11c magnetic beads (CD11c MicroBeads UltraPure, Miltenyi).
To isolate pMacs, mice were sacrificed using CO2 and 4 ml of ice-cold PBS injected into the peritoneal cavity. The peritoneal cavity was briefly massaged and cells recovered using a 10 ml syringe. For stimulation experiments pMacs were enriched by positive selection with F4/80 magnetic beads (Anti-F4/80 MicroBeads UltraPure, Miltenyi).
Clodronate Liposomes清除巨噬细胞后回输细胞解决方案：
清除剂注射方式：腹腔注射（不一定优选）
清除剂注射剂量：200ul
回输细胞的数量：3x10^6
回输细胞的时间点：清除剂给药后72h
实验数据一：
WT小鼠腹腔注射荷兰Liposoma巨噬细胞清除剂，72h后，Transfer回输WT，CD1d-KO小鼠的骨髓来源细胞。造模LPS诱导的炎性模型。根据实验数据，支持在LPS造模后，用CD1d-KO细胞重建的小鼠表现出对LPS诱导的炎症更高的易感性，与用WT细胞重建的小鼠相比，体温降低以及血液中细胞因子的浓度提高。数据支持CD1d在髓系细胞中对TLR反应的负向调节作用。
实验数据二：
WT小鼠腹腔注射荷兰Liposoma巨噬细胞清除剂，72h后，Transfer回输WT，CD1d-KO小鼠的骨髓来源细胞。调查CD36是否会导致CD1d-KO细胞中脂质摄取的增加。引入实验变量CD36，sulfosuccinimidyl oleate (SSO)：是一种长链脂肪酸,抑制脂肪酸向细胞转运。可以封闭阻断CD36。
CD36 是一种多功能糖蛋白，可作为多种配体的受体，包括血小板反应蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白或β淀粉样蛋白等蛋白质实体，以及氧化低密度脂蛋白 (oxLDL)、阴离子磷脂等脂质成分。长链脂肪酸和细菌二酰化脂肽。这些配体具有多价性，可以同时与多个受体结合，促进 CD36 簇的形成，从而启动信号转导和受体-配体复合物的内化。对辅助受体信号传导的依赖性明显是配体特异性的。细胞对这些配体的反应在肠道内的血管生成、炎症反应、脂肪酸代谢、味觉和膳食脂肪加工中发挥着关键作用。此外，CD36 结合长链脂肪酸，促进其转运到细胞中并参与肌肉脂质利用、脂肪能量储存和肠道脂肪吸收。从机制上讲，脂肪酸结合会激活下游激酶 LYN，磷酸化棕榈酰转移酶 ZDHHC5，并导致 CD36 去棕榈酰化和小凹胞吞作用。在小肠中，CD36 可能通过激活 MAPK1/3 (ERK1/2) 信号通路在膳食脂肪酸和胆固醇的近端吸收中发挥作用。它还涉及口腔脂肪的感知和偏好，介导味觉受体细胞中细胞内钙水平的增加。此外，CD36 是长链脂肪酸腹内侧下丘脑神经元感知以及能量和葡萄糖稳态调节的重要因素。作为血小板反应蛋白的受体，CD36 介导其抗血管生成作用，并与 THBS1 合作，响应游离脂肪酸升高而诱导足细胞凋亡。作为 TLR4:TLR6 异二聚体的辅助受体，CD36 在配体结合后促进单核细胞/巨噬细胞的炎症，通过 NLRP3 炎症小体的启动和激活，导致 NF-κ-B 依赖性细胞因子的产生和 IL1B 的分泌。此外，CD36 作为微生物二酰化脂肽的选择性和非冗余传感器，触发 NF-κ-B 依赖性 TNF 产生，并随后通过 TLR2:TLR6 异二聚体信号传导靶向脂筏依赖性途径中的高尔基体。在微生物感染的情况下，CD36 直接介导恶性疟原虫寄生的红细胞的细胞粘附和颗粒的内化，与 TLR 信号传导无关。
中文摘要：
细胞代谢的变化支撑着巨噬细胞的激活，但目前对关键免疫分子如何调节巨噬细胞的代谢程序知之甚少。在这里，我们揭示了抗原呈递分子CD1d在脂质代谢控制中的作用。我们展示了缺乏CD1d的巨噬细胞表现出代谢重编程，脂质代谢途径下调，外源性脂质进口增加。这种代谢重组为巨噬细胞增强对先天信号的反应做好了准备，因为CD1d缺失的细胞在刺激类 Toll 样受体后表现出更高的信号传导和细胞因子分泌。在机制上，CD1d通过控制脂质转运蛋白CD36的内吞作用来调节脂质进口，而阻断通过CD36的脂质摄取可以恢复巨噬细胞的代谢和免疫反应。因此，我们的数据揭示了CD1d作为巨噬细胞中一个炎症-代谢回路的关键调节因子，这一功能独立于其对T细胞反应的调控。
英文摘要：
Alterations in cellular metabolism underpin macrophage activation, yet little is known regarding how key immunological molecules regulate metabolic programs in macrophages. Here we uncover a function for the antigen presenting molecule CD1d in the control of lipid metabolism. We show that CD1d-deficient macrophages exhibit a metabolic reprogramming, with a downregulation of lipid metabolic pathways and an increase in exogenous lipid import. This metabolic rewiring primes macrophages for enhanced responses to innate signals, as CD1d-KO cells show higher signalling and cytokine secretion upon Toll-like receptor stimulation. Mechanistically, CD1d modulates lipid import by controlling the internalization of the lipid transporter CD36, while blocking lipid uptake through CD36 restores metabolic and immune responses in macrophages. Thus, our data reveal CD1d as a key regulator of an inflammatory-metabolic circuit in macrophages, independent of its function in the control of T cell responses.
论文信息：
论文题目：CD1d-dependent rewiring of lipid metabolism in macrophages regulates innate immune responses
期刊名称：Nature Communications
时间期卷：13, Article number: 6723 (2022)
在线时间：2022年11月7日
DOI：doi.org/10.1038/s41467-022-34532-x
产品信息：
货号：CP-005-005
规格：5ml+5ml
品牌：Liposoma
产地：荷兰
名称：Clodronate Liposomes and Control Liposomes
办事处：Target Technology（靶点科技）
