蛋白质被泛素-蛋白酶体系统降解需经过以下过程：①靶蛋白的泛素化；②靶蛋白的降解。三种重要的酶共同介导了靶蛋白泛素化过程：泛素活化酶（ubiquitin activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitin conjugating enzyme，E2）和泛素连接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）。E1水解ATP后与泛素分子C端形成硫酯键，然后E1将活化的泛素递交给E2，最后泛素在E3的募集作用下，从E2转移到靶蛋白上，或者靶蛋白首先与E3结合，泛素再转移过来。泛素化的靶蛋白最终进入26S蛋白酶体而被降解，而泛素分子则从泛素链中分离开来，从而实现重复利用。关于E1的作用机制及具体数目尚不明确，在人类组织中至少已发现了40多种E2及700多种E3。且E3具有高度的底物特异性，通过识别和结合特异的靶蛋白序列或降解决定子（degron），即N末端法则实现对靶蛋白的选择性降解。
泛素一蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway）是细胞内一个重要的蛋白质降解调节系统。通过对底物蛋白的多聚泛素化并经蛋白酶体降解，可以影响或调节多种细胞活动，包括：基因转录、细胞周期调节、免疫反应、细胞受体功能及肿瘤生长、炎症过程等。该途径也是一种动态的蛋白质双向修饰调控系统，在体内由泛素连接酶系统（E1-E2-E3）对底物进行泛素化修饰，去泛素化酶（DUB）家族负责通过水解泛素羧基末端的酯键、肽键或异肽键，将泛素分子特异性的从链接有泛素的蛋白质或者前体蛋白水解下来，起到去泛素化的作用，对蛋白降解进行反向调节，从而影响蛋白质的功能。
去泛素化酶是一类数量很大的蛋白酶家族，主要分为五个家族，分别是泛素羧基末端水解酶（UCH）家族，泛素特异性蛋白酶（USP/UBP）家族，Otubaim（OTU）家族，Josephin结构域蛋白家族及JAMM家族。
在细胞内去泛素化酶的功能可大致分为以下几种: (1)加工泛素前体, 产生自由的泛素分子; (2)移除蛋白质上的泛素链, 避免蛋白质被蛋白酶体降解, 从而稳定蛋白质; (3) 移除蛋白质上连接的非降解泛素化信号; (4)通过阻 止泛素分子与底物蛋白质一起被降解, 确保细胞内泛素分子的稳态; (5)参与细胞内游离泛素链的解体; (6)通过剪切泛素链, 编辑泛素链的类型。
去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes, DUB）：与泛素化修饰需要E1、E2及E3三种酶共同作用不同，去泛素化的过程只需要DUBs，且DUBs作用的底物蛋白是被泛素修饰的蛋白（图1）。DUBs通过水解泛素分子羧基末端的肽键、异肽键或酯键从而去除底物蛋白中的泛素或通过缩短共轭泛素链来抵消泛素化，进而抑制底物蛋白的降解(Vogel K and Isono E., 2024)。
图1 泛素化和去泛素化过程(Zheng et al., 2023)。泛素化过程由E1泛素活化酶、E2泛素偶联酶和E3泛素连接酶完成。E1酶激活泛素并将其转移到E2酶。然后，E2酶与E3酶相互作用，导致泛素从E2酶转移到特定的靶蛋白。泛素化蛋白可以被蛋白酶体识别和降解。泛素化可以通过去泛素化逆转，去泛素化是一种将泛素从靶蛋白中分离出来的过程。
去泛素化酶的分类
在真核生物中，根据催化机制的不同，DUBs可分为两大类：半胱氨酸蛋白酶家族和金属蛋白酶家族（图2）。其中，半胱氨酸蛋白酶家族包括泛素特异性蛋白酶（USPs）、泛素C端水解酶（UCHs）、Machado‑Joseph结构域蛋白酶（MJDs）、卵巢肿瘤蛋白酶（OUTs）、Motif与泛素分子结合的DUB家族蛋白酶（MINDYs）和含锌指泛素肽酶（ZUP/ZUFSP）六类；而金属蛋白酶家族只包含MPN(+)/JAMM蛋白酶家族(Clague et al., 2019)。根据当前已有的DUBs研究结果， Vogel K和Isono E两位研究者统计了拟南芥中DUBs的种类及其对应的结构域（图3）。
图2 特异性DUBs的催化机制(Vogel K and Isono E., 2024)。（A）以泛素二聚体为底物的半胱氨酸蛋白酶DUBs的催化机制。S1位点结合末端或远端泛素（UB环），而S1'位点结合近端泛素，该泛素有一个游离的C端或与靶蛋白结合。这些结合位点有助于将远端泛素的C端甘氨酸（G）和近端泛素的赖氨酸（K）之间的异肽键定位在活性位点附近。活性位点三联体由半胱氨酸（C）、组氨酸（H）和天冬氨酸（D）组成。在第一步中，半胱氨酸侧链的硫阴离子在异肽键的亲电碳原子上发生亲核攻击。半胱氨酸侧链的硫阴离子被质子化组氨酸侧链稳定，而组氨酸侧链又被天冬氨酸侧链稳定。亲核攻击后，催化位点半胱氨酸的硫原子与异肽键的碳原子之间形成临时键，导致异肽键断裂，近端泛素释放。亲电的碳原子是硫酯键的一部分，可以被来自水分子的亲核氧攻击。随后，来自水的羟基与远端泛素的C端甘氨酸的碳原子结合，将远端泛素从催化侧移除。催化位点组氨酸被来自水分子的第二个质子质子化；（B）金属蛋白酶DUBs的催化机理。远端泛素和近端泛素分别与S1和S1'位点结合，使异肽键靠近活性位点。活性位点包括一个丝氨酸（S）、一个天冬氨酸（D）、两个组氨酸（H）、一个谷氨酸（E）和一个由组氨酸和天冬氨酸配位的锌质子（Zn2+）。在泛素结合之前，活性位点的锌质子与水分子发生反应，这使得水分子处于活性中心，允许它的1个质子与谷氨酸侧链上带负电的氧原子结合，进而形成一个带负电荷的羟基，这个羟基此时处于攻击异肽键的亲电碳的最佳位置。当与泛素结合时，来自异肽键的亲电碳受到来自水的亲核氧的攻击，该反应通过活性位点丝氨酸对异肽键羰基氧原子的暂时稳定促进。水的亲核攻击引起异肽键的水解，导致远端和近端泛素的释放。远端泛素的C末端甘氨酸与来自水分子的羟基结合，而近端泛素赖氨酸侧链的氨基则与来自水分子的质子结合。参与反应的侧链官能团用骨架式表示，共价键用黑色实线表示，非共价键用黑色虚线表示。
图3 拟南芥DUBs的种类及结构域(Vogel K and Isono E., 2024)。
UbiQBio成立于2010年,位于荷兰阿姆斯特丹,专注于泛素(ubiquitin)及其类似蛋白的研究工具开发。公司由教授Huib Ovaa、Farid El Oualid和Alfred Nijkerk创立,致力于为药物发现。技术平台由三项专有技术组成: Ubi0Bl0ckm.Ubi0-Cick" 和 Ubi0-Swn™，这使我们能够开发泛素 (Ub)领域所缺乏的产品和服务，利用这些化学合成技术，我们可以构建件何U6缀合物、Ub突变体及其组合。现在可以更有效地开发已知试剂，但最重要的是构建远远超出任何当前可用(生物)方法所能达到的试剂。借助我们的专有技术平台，我们能够使用自动同相肽合成技术合成天然构象的位点选择性泛素化肽。
