背景介绍
● DBCO：二苯并环辛炔（无铜点击化学核心基团）
● carboxyrhodamine 110：羧基罗丹明 110（荧光染料，绿色荧光）
● DBCO-carboxyrhodamine 110：DBCO 修饰羧基罗丹明 110 荧光探针
● 叠氮细胞： Ac₄ManNAz 代谢标记叠氮细胞
● 工作原理：无铜点击化学反应（SPAAC），DBCO 与叠氮（-N₃）自发共价结合，实现细胞荧光标记
染料：Carboxyrhodamine 110（CR110）绿色荧光
激发波长：~495 nm
发射波长：~520 nm
全程无需铜离子、无需催化剂，细胞毒性极低
•待标记细胞：Ac4ManNAz 预处理过的叠氮细胞（实验组）
•阴性对照：不加 Ac4ManNAz 的普通细胞
•试剂
-DBCO-Carboxyrhodamine 110 粉末
-DMSO（母液溶剂）
-PBS 缓冲液
-基础培养基（无血清培养基最佳）
4-% 多聚甲醛（固定用，可选）
•母液配制
-配制 10 mM DBCO-CR110 母液：粉末溶于无水 DMSO
-分装避光 -20℃保存，避免反复冻融
-工作终浓度：1 μM（细胞标记通用初始测试浓度）
1.收集细胞
贴壁细胞胰酶消化 / 悬浮细胞直接收集，1200 rpm，5 min 离心弃上清。
2.PBS 洗涤 1 次，重悬细胞。
3.稀释探针
用无血清基础培养基稀释 10 mM 母液至工作浓度 1 μM。
禁止用含叠氮钠 NaN₃的 PBS / 培养基，会竞争性封闭反应！
4.孵育标记
细胞重悬于含 DBCO-CR110 的无血清培养基中，
室温避光孵育 30 min。
5.充分洗涤
孵育结束，PBS 洗涤 2~3 次，每次 1200 rpm 5 min，洗去未结合游离染料。
6.检测
重悬于 PBS，直接上机流式细胞仪绿色通道检测。
1.细胞爬片经 Ac4ManNAz 代谢培养后，吸弃培养基。
2.PBS 轻柔清洗爬片 1 次。
3.加入含 1 μM DBCO-CR110 的无血清培养基。
4.室温避光孵育 30 min。
5.PBS 充分洗涤 3 次，洗去游离探针。
6.可选：4% 多聚甲醛室温固定 15 min。
7.DAPI 染核，封片，共聚焦显微镜观察。
•空白对照：未加 Ac4ManNAz、未加探针的原始细胞
•染料本底对照：未用 Ac4ManNAz，仅加 DBCO-CR110 孵育洗涤
（验证非特异性吸附）
•叠氮实验组：Ac4ManNAz 细胞 + DBCO-CR110（阳性信号组）
•绝对不能含叠氮钠（NaN₃）
培养基、PBS 里的抑菌叠氮钠会大量竞争 DBCO，直接导致标记失败、无信号。
•全程避光
CR110 荧光极易光淬灭，孵育、洗涤、检测全程铝箔包裹避光。
•血清影响小，但无血清孵育背景更低
血清蛋白轻微非特异吸附，无血清条件信噪比好。
•孵育时间不要过长
30 min 足够反应；超过 1h 只会增加非特异性吸附，不增强信号。
•DMSO 终浓度＜0.1%，避免细胞毒性。
•该标记在细胞膜表面，不进入胞内，对应唾液酸膜糖蛋白定位。
