荷兰Liposoma是巨噬细胞清除剂Clodronate Liposomes氯膦酸盐脂质体的发明人和开发者。作为金标准的体内单核巨噬细胞清除试剂，其凭借稳定的化学性质、高效的清除能力及良好的生物相容性，已成为全球单核巨噬细胞清除的不二药物。产品被引频频见刊Cell，Nature和Science，助力突破发现，拓展科学边界。
巨噬细胞是参与广泛生理和病理过程的关键高度异质性先天免疫细胞。使用ClodronateLiposomes氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞通常用于研究小鼠体内巨噬细胞的功能。对受体小鼠巨噬细胞先清除，然后回输供体的巨噬细胞细胞，在疾病模型中研究回输巨噬细胞的功能。本Protocol以LPS脓毒症模型为例，用体外分化、慢病毒转导的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）对受体小鼠回输，先使用荷兰Liposoma的ClodronateLiposomes氯膦酸盐脂质体清除受体小鼠巨噬细胞，然后回输供体小鼠来源巨噬细胞进行重建。该实验策略可灵活应用于其他实验方案。实验框架设计如下：
实验步骤
一. 骨髓细胞分离
可以参考公众号：Target Technology关于，有详细的protocol（Protocol：小鼠骨髓巨噬细胞的分离，分型和分选）。
1.使用CO2装置麻醉小鼠，随后进行颈椎脱臼。
2.用镊子和剪刀去除骨骼上的皮肤及骨骼肌组织，并在10 cm培养皿中用冷PBS洗涤骨骼。
a. 将骨骼放入含PBS的新10 cm培养皿中，在膝关节处剪断，分离股骨和胫骨。
b. 去除残留组织，并在新培养皿中再次用PBS洗涤。
注意：须清除骨骼上的骨骼肌，以避免组织细胞污染。
3.用含2% FBS的冷PBS灌满3 mL注射器。
a. 剪去骨骼两端，轻柔地将连接28号针头的注射器插入骨髓腔，推动PBS溶液，冲洗骨髓并将其收集于空的10 cm培养皿中。
b. 用PBS/FBS溶液重新灌满注射器，重复该步骤，直至所有骨髓组织均被冲洗至培养皿中。
注意：PBS/FBS溶液需在每次骨髓分离前新鲜配制。
当骨髓被冲洗后，骨的颜色由深红色变为白色（见图 1A）。
所获得的骨髓细胞数量取决于小鼠的年龄与遗传背景。通常以6–8周龄小鼠作为理想的骨髓供体。
4.用5 mL移液管轻柔地上下吹打 PBS/FBS/骨髓混合物数次，以充分分散骨髓组织。然后将溶液转移至15 mL离心管中，继续上下吹打数次。将离心管置于冰上。
5.裂解红细胞（一般不建议，建议重点公众号的protocol）。
a. 离心机（1400 rpm）在25℃下离心5分钟，以沉淀细胞。
b. 吸取上清液。加入5 mL红细胞裂解液和1 mL FBS。重悬细胞，并在室温下孵育5分钟裂解红细胞。
注意：红细胞裂解缓冲液对骨髓细胞有毒性。加入FBS可降低细胞毒性并提高细胞活性。
6用冷PBS清洗细胞。
a. 1400 rpm离心5分钟（4℃）沉淀细胞。
b. 将细胞重悬于10 mL冷PBS中，再次离心（1400 rpm）5分钟沉淀细胞。
c. 重复清洗两次。
7.将细胞重悬于1 mL预热至37℃的RPMI 1640充分培养基中。随后加入含有6 mL预热RPMI 1640充分培养基（表2）的10 cm细胞培养皿。
RPMI 1640充分培养基 | ||
试剂 | 终浓度 | 500 mL用量 |
FBS | 10% | 50 mL |
青霉素-链霉素双抗 | 1% | 5 mL |
RPMI 1640 | / | 补足至500 mL |
于4℃保存，最长1个月 | ||
8.在37℃和5% CO2下孵育5小时去除基质细胞。
注意：5小时后，基质细胞会附着在培养皿表面，而骨髓干细胞和前体细胞保持未附着或悬浮状态（图 1B）。
关键： 此步骤对于去除基质细胞是必需的，如果允许其生长，它们会附着在培养皿上并与分化的BMDMs混合无法区分。此步骤对于BMDMs的纯度至关重要。
9.于5小时后，小心收集含有未附着细胞的培养基至 15 mL离心管中。注意不要扰动附着的细胞。
a. 1400 rpm离心5分钟（4℃）沉淀细胞，并将细胞重悬于1 mL RPMI 1640充分培养基中。
b. 使用血球计数板（Cat#84107ES）计数细胞数量
图 1. 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的制备
(A) 小鼠长骨在骨髓冲洗前后的状态对比。(B) 几个关键时间点的代表性细胞图像。
二.慢病毒转导
在此方案中，我们在BM细胞分化为BMDMs之前使用慢病毒介导的DNA转移来修饰 BM 细胞 (Miller and Blystone, 2015)。在我们的实验中，我们用携带SOCS1 cDNA的慢病毒（SOCS1-慢病毒）转导BM细胞，使用GFP-慢病毒作为对照 (Du et al., 2020)。我们发现，转导BM前体细胞比直接转导充分分化的BMDMs更能有效地将基因递送到BMDMs中。
1.将1 mL BM细胞（最多2x106个细胞）加入到含有6 mL RPMI 1640培养基的新10 cm细胞培养皿中。
注意：通常从小鼠身上可以获得1-5 x 106个骨髓细胞，具体取决于小鼠的年龄和大小。
2.解冻慢病毒储备液。向慢病毒溶液（0.1-0.2 mL）中加入Polybrene至终浓度为6 μg/mL。在25℃下孵育5分钟。
关键：Polybrene对于提高慢病毒转导效率是必需的。基本原理是Polybrene可以中和细胞表面和病毒颗粒之间的电荷排斥。
3.将慢病毒-Polybrene复合物以10的感染复数 (M.O.I.) 加入培养皿中的BM细胞。在 37℃和5% CO2下孵育细胞48小时。
三.BMDM制备和分化
使用细胞因子将转导的BM细胞分化为 BMDMs。（公众号：Target Technology，Protocol：小鼠骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）的制备）
BMDM分化培养基 | ||
试剂 | 终浓度 | 500 mL用量 |
RPMI 1640充分培养基 | 70% | 350 mL |
L929 条件培养基（强烈建议使用细胞因子） | 30% | 150 mL |
于4℃保存，最长1个月 | ||
1.培养48小时后，小心吸出含有慢病毒的培养基，并替换为分化培养基。
注意：此时大多数BM细胞已附着在培养板上。
2.在37℃和5% CO2下继续培养7天。每2天更换一次新鲜的分化培养基。
注意：7天后，培养细胞（BMDMs）的形状显得更长且更像椭圆形（图 1B）。
转导的BMDMs呈GFP阳性。可以通过在荧光显微镜下观察细胞来估计转导效率。可以通过Western blot评估递送基因（如 SOCS1）的表达。
四. 脂质体注射
为了清除巨噬细胞，需要将含氯膦酸盐的脂质体（Cat#： C-005）静脉注射到小鼠体内。我们通过眼眶后静脉窦注射这些脂质体(Yardeni et al., 2011)。
1.注射前两小时，取出氯膦酸盐脂质体（Cat# ：C-005）和对照脂质体（Cat#：P-005），使其平衡至室温。
注意：氯膦酸盐脂质体和PBS脂质体（对照脂质体）储存在4℃，不可冻存。
2.颠倒脂质体管几次（8-10次），直到液体变得均匀。
3.使用带有28号针头的1 mL注射器吸取0.2 mL氯膦酸盐脂质体或对照脂质体。
关键：注射小鼠前务必去除任何气泡。将空气注入静脉可能导致死亡。
4.在II级B2型生物安全柜中使用精密蒸发器用异氟烷麻醉小鼠。
a. 将小鼠放入腔室并紧紧盖上盖子。
b. 将氧气流量计和异氟烷蒸发器设置分别调整为1 L和0.05-4%。
c. 等待小鼠进入深度昏迷状态，然后将其从腔室中取出。可以通过足部反射消失来确认麻醉。
注意：当小鼠侧卧时呼吸会变得有节奏，证明小鼠处于适当麻醉状态。不要让小鼠过度暴露于异氟烷，过度暴露可能导致小鼠死亡。由于麻醉的小鼠可能在15秒内醒来，注射应在6-7秒内完成。
5.注射前立即通过颠倒含有脂质体的注射器6-8次来重悬脂质体溶液，使脂质体液体均匀。
6.缓慢将0.2 mL脂质体注射到眼眶后窦中。
a. 注射时，将麻醉的小鼠侧放，拉开眼睛上方和下方的皮肤，使眼睛略微突出。
b. 在眼底，将针头在内眦处以约30°角插入眼眶后窦（见图2）。有关眼眶后注射的更多详细信息，请参阅参考文献 (Yardeni et al., 2011)。
注意：如果针头插入正确位置，应该感觉不到阻力，注射后出血很少或不出血。脂质体溶液也可以从尾静脉注射或腹腔注射。
7.注射完成后，将小鼠放回笼中。
注意：需观察小鼠，确保其从麻醉中恢复后方可离开。小鼠通常需要15-20秒恢复。
图2.使用1 mL注射器进行小鼠眼眶后静脉注射
五.巨噬细胞清除效果验证
注射脂质体48小时后，可以通过使用荧光激活细胞分选 (FACS) 分析脾脏中的F4/80+常驻巨噬细胞来确认巨噬细胞的消除。需要此验证步骤来建立实验条件。一旦建立了最佳实验条件，此步骤并不总是必要的。
1.注射脂质体48小时后，使用CO2处死小鼠，随后进行颈椎脱臼。
a. 立即用70%乙醇消毒皮肤，用手术剪打开腹腔并采集脾脏。
b. 将脾脏放入装满含有10% FBS的冷RPMI1640的10 cm培养皿中。
2.将脾脏放在70 μm细胞筛上，使用1 mL注射器的末端将脾脏捣碎穿过细胞筛。将过滤后的细胞悬液收集到15 mL管中。
a. 离心细胞（1400 rpm，5分钟，4℃）。将细胞重悬于5 mL红细胞裂解缓冲液中，并在25℃下孵育5分钟以裂解红细胞。
b. 加入10 mL冷PBS。离心（1400 rpm，5分钟）收集细胞。
c. 通过重复此步骤再次用冷PBS清洗细胞。将细胞保持在冰上。
3.FACS分析。
a. 将细胞在0.1 mL Live and Dead Violet Viability 溶液中于冰上孵育30分钟。用冷 PBS 清洗细胞一次并离心（1400 rpm，5分钟，4℃）。可用Calcein-AM/PI 活细胞/死细胞双染试剂盒代替
b. 用抗小鼠MHCII FITC（1:200稀释）和抗小鼠F4/80 APC（1:200稀释）在黑暗中于冰上染色细胞30分钟。用冷PBS清洗细胞一次。
c. 使用BD LSRFortessa仪器进行FACS分析。
d. 使用FlowJo软件(V10)分析FACS数据（图3）。
注意：通常在注射一次氯膦酸盐脂质体48小时后，可以观察到常驻巨噬细胞的成功清除（减少>90%）。图3显示了在48小时后注射一剂或两剂氯膦酸盐脂质体后脾脏巨噬细胞清除的示例 (Du et al., 2020)。
图3. FACS验证巨噬细胞清除
A.小鼠脾脏巨噬细胞在用对照脂质体、一次或两次氯膦酸酯脂质体处理后48小时的代表性FACS分析图。***p<0.001，单因素方差分析。B.FACS分析的定量数据（数据引自doi:10.1016/j.devcel.2020.10.023）。
六.巨噬细胞重建
氯膦酸盐脂质体处理两天后，可以用新的巨噬细胞重建巨噬细胞清除后的小鼠。在此方案中，我们使用了慢病毒转导的BMDMs。这些BMDMs通过眼眶后静脉窦静脉注射递送至小鼠体内。由于内源性巨噬细胞会在清除后1-2周内重新填充小鼠 (van Rooijen et al., 1989)，因此只有4-5天的时间窗口可以在小鼠中检测外源性巨噬细胞。
因此，至关重要的是要规划实验，以便BMDM的体外分化在此窗口期内完成并准备好使用。
1.吸出BMDMs的培养基，用10 mL PBS清洗细胞。加入5 mL Trypsin-EDTA并在 37℃下孵育5分钟以使细胞从培养板上解离。
注意：BMDMs通常在条件培养基中培养第7天即可使用。分化的BMDMs示例见图 1B。
2.使用无菌细胞刮刀将细胞从培养板上刮下。
a. 将细胞转移到50 mL锥形管中。用5 mL PBS (pH 7.0)冲洗培养皿2-3次，并将冲洗液转移到含有收获细胞的离心管中。
b. 轻轻吹打细胞溶液几次以分散细胞团块。
3.1400 rpm离心5分钟（25℃）沉淀细胞。用无菌PBS (pH 7.0)清洗细胞 2-3 次。
4.用5 mL无菌PBS重悬细胞。用血细胞计数板计数细胞。
5.1400 rpm离心5分钟（25℃）沉淀细胞。去除上清液，并将细胞重悬于无菌PBS中，浓度为107个细胞/mL。
6.如上所述，使用异氟烷麻醉受体小鼠（巨噬细胞清除后的小鼠）。
7.用1 mL注射器吸取0.2 mL细胞溶液。使用28号针头通过眼眶后静脉窦缓慢注射0.2 mL BMDM溶液。
注意：每只小鼠注射2 x 106个BMDMs。可以注射0.2 mL PBS作为对照。BMDM溶液也可以通过尾静脉注射。
8.注射完成后，将小鼠放回笼中。
注意：需观察小鼠，确保其从麻醉中恢复后方可离开。
七.LPS诱导的脓毒症与分析
重建后的小鼠是研究外源性巨噬细胞的体内平台。BMDM注射36小时后，小鼠即可用于实验。在此方案中，我们使用LPS诱导的脓毒症模型来研究重建BMDMs的体内功能 (Du et al., 2020)。
1.将LPS溶解在无菌 PBS (pH 7.0) 中，浓度为10 mg/mL。
2.称量小鼠体重。根据体重，计算要注射给小鼠的LPS溶液体积，剂量为20 μg/kg（体重）。
注意：对于LPS模型，小鼠的理想体重应>18克。
3.用1 mL注射器取适量的LPS溶液，并使用28号针头腹膜内注射小鼠。
注意：注射时，在小鼠腹部右下象限以30°-40°角插入针头。一旦针头穿过皮肤和腹膜衬里，角度应与胃平行以避免刺穿器官。PBS可用作注射对照。
4.分析小鼠。
注意：LPS注射后几小时内，小鼠会出现体温过低，在此LPS剂量下，多达50%的C57BL/6小鼠可能在72小时内死亡。LPS注射会引起严重的全身炎症和多器官损伤。可以在不同时间点处死小鼠进行分析。
八.预期结果
在本研究中，我们旨在评估SOCS1是否在YTHDF1下游发挥调节巨噬细胞激活的作用。为此，我们从野生型(WT)和YTHDF1(-/-)小鼠中衍生出BMDMs，然后分别用SOCS1-慢病毒或GFP (Ctrl)-慢病毒转导这些WT和YTHDF1(-/-) BMDMs。我们清除了WT小鼠的巨噬细胞，然后用SOCS1-或GFP (Ctrl)-转导的WT或YTHDF1(-/-) BMDMs重建这些小鼠。最后，我们将这些重建的小鼠置于LPS诱导的脓毒症模型中。如图4所示，与接受Ctrl-转导WT BMDMs的小鼠相比，接受 Ctrl-转导 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠在 LPS 攻击后死亡率要高得多（24 小时内 100% 死亡）（图 4A），这是预期的。接受 Ctrl-转导 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠产生的血清炎症细胞因子水平远高于接受 Ctrl-转导 WT BMDMs 的小鼠（图 4B），这也是预期的。这些观察结果表明慢病毒转导和清除/重建程序均成功（因为所有受体小鼠均为 WT 小鼠，如果程序不起作用，受体小鼠的表型应相同）。当接受 SOCS1-转导 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠接受 LPS 治疗时，高死亡率得到了预防（图 4A），并且血清炎症细胞因子水平降低到了 Ctrl 水平（图 4B）。这些数据表明，清除/重建程序确实是研究外源性巨噬细胞体内功能的系统。
图 4. 过表达 SOCS1 可纠正小鼠 YTHDF1⁻/⁻巨噬细胞的过度炎症表型
(A) 经 LPS 刺激后，分别回输野生型（WT）或 YTHDF1⁻/⁻骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）（并转染 SOCS1 慢病毒或对照慢病毒）的巨噬细胞剔除小鼠的生存曲线；p < 0.0001（YTHDF1⁻/⁻ + 对照 + LPS 组与其余各组比较）。
(B) 经 LPS 刺激后，分别回输野生型（WT）或 YTHDF1⁻/⁻骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）（并转染 SOCS1 慢病毒或对照慢病毒）的巨噬细胞剔除小鼠的血清细胞因子浓度。*p < 0.05，**p < 0.01；*p < 0.001，****p < 0.0001，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。所有数据均以平均值 ± 标准差（mean ± SD）** 表示。
