信使核糖核酸（mRNA）疗法在疫苗研发、蛋白替代治疗、基因编辑、免疫治疗 及组织再生领域几乎拥有无限临床应用潜力。mRNA 疫苗成功抑制病毒肺炎全球大流行，印证了这类疗法的临床价值。基于该突破，我们预期面向其他适应症的 mRNA 疗法临床转化进程将迎来快速增长。但想要充分释放 mRNA 药物的治疗潜力，该领域亟需开发能够靶向病变细胞与组织的递送载体系统。
研发递送载体十分必要：裸露 mRNA 的药代动力学特性较差，在抵达靶细胞细胞质（蛋白质翻译发生的场所）前就会被核酸酶快速降解并清除。高效递送系统需要实现三大功能：保护 mRNA 免受体内核酸酶降解、促使靶细胞摄取载体、介导 mRNA 从胞内体释放至细胞质。脂质纳米颗粒（LNP）是已在人体临床试验中得到验证的 RNA 递送载体 ，但绝大多数 LNP 仅能将 mRNA 递送至免疫细胞与肝细胞，难以靶向其他细胞。肌肉注射疫苗可将 mRNA 有效递送至免疫细胞；而蛋白替代疗法、免疫治疗通常需要静脉给药。例如，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的小干扰 RNA（siRNA）脂质纳米颗粒药物帕替西兰，经静脉给药靶向肝细胞，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性。此外，英特利亚治疗公司与再生元制药近期完成的一项临床试验取得阳性结果，该研究利用 RNA-LNP 介导基因编辑技术治疗淀粉样变性。以上成果均证实 RNA-LNP 具备疾病治疗潜力。但迄今为止，实现 RNA 全身递送至肝脏、脾脏以外脏器的相关研究进展十分有限。
若要实现难转染细胞的 mRNA 递送，可对 mRNA-LNP 的多项设计参数与给药方式进行优化调整，包括脂质组分、mRNA 序列 、给药途径 以及引入主动靶向配体。脂质纳米颗粒一般包含四类脂质原料：可电离脂质、两亲性磷脂（即辅助脂质）、胆固醇与聚乙二醇（PEG）修饰脂质。可电离脂质是 LNP 研发的核心，胞内体内 pH 值下降时，该脂质发生质子化，进而促进 mRNA 逃离胞内体。然而，研究人员筛选了海量脂质文库，仅找到极少数材料能够实现肝脏、脾脏外组织的 mRNA 递送。更换给药途径可突破该局限，本实验室 与其他研究团队 均已证实，更换给药方式可将 mRNA 递送至心脏 、大脑、肺部 等脏器。向体系中添加带电两亲性磷脂同样能够实现肝外 mRNA 递送，该改造可使目标蛋白的表达位点从肝脏转移至脾脏或肺部。
尽管上述技术取得诸多进展，但利用 mRNA-LNP 靶向胰腺细胞递送 mRNA 依旧存在巨大挑战。该递送技术一旦落地，可为胰腺癌、糖尿病等无法治疗胰腺疾病提供挽救生命的治疗方案。胰腺兼具内分泌与外分泌双重功能：胰岛细胞负责维持机体葡萄糖稳态，腺泡细胞则向十二指肠分泌消化酶。已有研究通过病毒递送载体证实了胰腺 mRNA 递送的临床前景。例如，吉特斯团队研究表明，借助病毒载体向胰腺递送基因，可再生分泌胰岛素的 β 细胞，用于治疗自身免疫性糖尿病。病毒载体转染细胞效率虽高，但存在基因组整合风险，且免疫原性强，难以实现多次给药。除此之外，若利用病毒载体治疗胰腺疾病，需要借助内镜逆行胰胆管造影术通过胰管注射给药，该操作属于有创手术，还存在诱发胰腺炎的风险。
为替代病毒基因治疗方案，我们着手研发 mRNA-LNP，以期建立非病毒胰腺基因递送技术，同时降低给药操作的侵入性。为此我们选用腹腔注射给药：该方式可选择性将药物递送至腹腔病灶，适用于卵巢肿瘤、胰腺肿瘤等腹腔肿瘤治疗。与静脉给药相比，腹腔给药能够降低全身毒副作用、提升药物生物利用度；同时纳米颗粒在腹腔内滞留时间更长，可延长与腹腔脏器靶组织的接触时长。
本文报道一种可强效、特异性向胰腺递送 mRNA 的脂质纳米颗粒配方。实验证实，即便采用化学结构不同的各类可电离脂质制备 LNP，腹腔注射 mRNA-LNP 后均可在胰腺内产生高水平目标蛋白。该递送方案主要诱导胰腺胰岛内负责分泌胰岛素的 β 细胞表达外源蛋白。我们进一步证实，腹腔巨噬细胞分泌的胞外囊泡（EV）可辅助完成 mRNA 递送，且该递送体系不会引发全身毒性。综合上述实验结果，mRNA-LNP 是一种可靠的非病毒载体，能够在传统手段难以转染的胰腺细胞中诱导外源蛋白表达。
腹腔注射（IP）相对于静脉注射（IV）提高胰腺的表达水平：
本研究采用三种不同可电离类脂质分别制备搭载荧光素酶 mRNA（mLuc）的脂质纳米颗粒（LNP），三类类脂质分别为 (A) 306Oi10、(B) 200Oi10、(C) 514O6,10；脂质摩尔配比统一为：35% 类脂质、16% 二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、46.5% 胆固醇、2.5% 聚乙二醇修饰脂质。将各组制剂给药至 C57BL/6 小鼠，mRNA 给药剂量 0.5 毫克每千克体重，每组 3 只小鼠。
给药 3 小时后，给小鼠注射 D - 荧光素底物，随后处死并解剖分离脏器，借助活体成像系统（IVIS）开展离体荧光发光成像。
左侧图版为各主要脏器具有代表性的活体成像图；中间图版对 mLuc 荧光素酶表达水平进行定量统计；右侧图版展示单个脏器的蛋白表达量占全部脏器总表达量的百分比。
相较于静脉注射（IV）给药途径，腹腔注射（IP）能够提升全部配方 LNP 的 mRNA 递送效率。
腹腔注射后，腹腔巨噬细胞参与介导 mRNA 向胰腺的递送过程：
(A) 向小鼠腹腔注射搭载 Cy5 标记荧光素酶 mRNA（Cy5-mLuc）的脂质纳米颗粒，给药剂量 0.5 mg/kg。注射完毕后立刻处死，收集腹腔灌洗液用于流式细胞术检测。结果显示 Cy5-mLuc 可结合于 B 细胞、T 细胞以及 CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞。
(B) B 细胞、T 细胞与 CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞中 Cy5-mLuc 的平均荧光强度（MFI）统计结果。
(C) 淋巴细胞迁移并不会促进 mRNA 向胰腺递送。本实验选用野生型（wt）NOD 小鼠与缺失成熟淋巴细胞的 NOD/SCID 小鼠，腹腔注射携带荧光素酶 mRNA（mLuc）或 Cy5 标记 mRNA 的脂质纳米颗粒（给药剂量 0.5 mg/kg）；3 小时后处死小鼠，开展离体活体成像系统（IVIS）发光检测。淋巴细胞缺失与否，不会改变胰腺内荧光素酶表达水平，也不会改变 Cy5 荧光信号在胰腺的分布情况。
(D) 设置对照组小鼠腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS），实验组小鼠腹腔注射氯膦酸二钠脂质体以清除体内巨噬细胞。48 小时后，全部小鼠腹腔注射 mLuc 脂质纳米颗粒，利用活体成像系统定量检测胰腺内生物发光强度。巨噬细胞清除组小鼠的胰腺转染效率显著下降。
论文信息：
论文题目：Ionizable lipid nanoparticles deliver mRNA to pancreatic β cells via macrophage-mediated gene transfer
期刊名称：Science Advances
时间期卷：Vol 9, Issue4(2023)
在线时间：2023年1月27日
DOI: 10.1126/sciadv.ade1444
产品信息：
货号：CP-005-005
规格：5ml+5ml
品牌：Liposoma
产地：荷兰
名称：Clodronate Liposomes&Control Liposomes
办事处：靶点科技
Clodronate Liposomes氯膦酸盐脂质体腹腔注射清除巨噬细胞后，特异性靶向胰腺递送 mRNA脂质纳米颗粒递送。荷兰Liposoma巨噬细胞清除剂ClodronateLiposomes见刊于Science Advances：可电离脂质纳米颗粒通过巨噬细胞介导的基因递送途径，将信使核糖核酸递送至胰腺 β 细胞。
Liposoma巨噬细胞清除剂Clodronate Liposomes氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞的材料和方法：
All animal experiments were conducted using institutionally approved protocols (Institutional Animal Care and Use Committee). C57BL/6 mice (female unless otherwise indicated) were obtained from Charles River Laboratories, Wilmington, MA. STZ mice (males) and NOD and NOD/SCID mice (females) were obtained from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). STZ mice exhibited hyperglycemia (blood glucose > 250 mg/dl) upon arrival. In experiments involving clodronate liposomes, clodronate liposomes and control liposomes were purchased from Liposoma (Amsterdam, The Netherlands). Mice received intraperitoneal injections of 200 μl of clodronate or control liposomes 48 hours before LNP treatment. For fluorescence and luminescence studies, dissected organs were imaged using an IVIS (Perkin Elmer). In experiments using mRNA encoding luciferase, mice received an intraperitoneal injection of 130 μl of d-luciferin (30 mg/ml) 15 min before imaging. Blood samples were drawn via submandibular bleed and collected in Microtainer Serum Separator tubes (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
巨噬细胞清除材料和方法文献截图：
