活细胞超分辨显微技术可实现衍射极限以下生物结构动态过程的成像。本文提出增强型超分辨径向涨落算法（eSRRF），相较原始 SRRF 方法，该算法能够大幅提升图像保真度与分辨率。eSRRF 内置基于图像数据的自动化参数优化流程，可直观反映分辨率与图像保真度二者间的权衡关系。
我们在多种成像模态与生物体系中验证了 eSRRF 算法的成像效果。值得一提的是，通过与多焦点显微技术联用，我们将 eSRRF 拓展至三维成像维度，实现了每秒约一套三维立体图像采集速度的活细胞体层超分辨成像。
eSRRF 是一种易上手的超分辨成像方案，可在各类实验条件下提取有效成像信息，同时抑制成像伪影。该算法的参数预测策略具备通用性，有助于推动超分辨显微成像领域实现无偏数据分析。
所有实验操作均遵循欧洲动物保护与使用委员会颁布的实验动物准则（86/609/CEE），并获得艾克斯 - 马赛大学伦理委员会审批（审批编号：G13O555）。实验所用原代神经元取自妊娠雌性威斯塔大鼠（Janvier Labs）孕 18 天（E18）雌雄胎鼠的海马组织。解剖分离海马组织，经胰酶消化后机械吹打制成细胞悬液，接种于直径 18 mm、1.5H 号圆形盖玻片，接种密度 30000 个细胞 / 平方厘米；细胞先在含血清铺板培养基中孵育 3 小时，铺板培养基配方为：基础低必需培养基（MEM）添加 10% 胎牛血清（FBS）、0.6% 葡萄糖、0.08 mg/mL 丙酮酸钠、100 单位 / 毫升青链霉素混合液。随后将盖玻片细胞面向下转移至铺有长满胶质细胞的培养皿中，胶质细胞预先使用 NB + 培养基条件化处理；NB + 培养基成分为：神经基础培养基（Neurobasal）添加 2% B27 添加剂、100 单位 / 毫升青链霉素、2.5 μg/mL 两性霉素 B，采用 Banker 法完成神经元共培养。
细胞培养至第 6–9 天，使用脂质转染试剂 Lipofectamine（2 μL，赛默飞）对神经元进行转染，转染质粒选用以下两种之一：1 μg pEGFP–α- 微管蛋白质粒（Clontech，货号 632349）或 pSkylan-NS–α- 微管蛋白质粒。pSkylan-NS–α- 微管蛋白质粒通过吉布森组装法⁷⁵构建：以 mScarlet–α- 微管蛋白质粒（Addgene 质粒编号 #8504574）为骨架，将其中 mScarlet 荧光蛋白序列替换为 Skylan-NS 序列（Addgene 质粒编号 #8678558）；组装体系混合酶体系包含：0.005 单位 / 微升 T5 核酸外切酶（NEB，货号 M0663S）、0.033 单位 / 微升 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（Finnzymes，货号 F-553L）、5.33 单位 / 微升 Taq DNA 连接酶（NZYTEch，货号 MB42601）。转染 24–48 小时后开展活细胞成像实验。成像前将神经元换为 E 型休眠培养基（Brainbits），培养基添加 2% B27、2 mM 谷氨酰胺补充剂（Glutamax）与 0.4% D - 葡萄糖；整套成像过程中细胞置于恒温湿控载物台培养系统（Okolab），36℃恒温维持细胞活性。
All procedures were in agreement with the guidelines established by the European Animal Care and Use Committee (86/609/CEE) and were approved by the Aix-Marseille University ethics committee (agreement no. G13O555). Primary neuronal cell culture was produced by extracting hippocampi from E18 rat pups of both sexes from pregnant female Wistar rats (Janvier Labs). Hippocampi were dissected and homogenized by trypsin treatment followed by mechanical trituration and seeded on 18-mm diameter, round, no. 1.5H coverslips at a density of 30,000 cells cm−2 for 3 h in serum-containing plating medium (MEM with 10% FBS, 0.6% added glucose, 0.08 mg ml−1 sodium pyruvate and 100 UI ml−1 penstrep). Coverslips were then transferred, cells down, to Petri dishes containing confluent glia cultures conditioned in NB+ medium (neurobasal medium supplemented with 2% B27, 100 UI ml−1 penstrep and 2.5 µg ml−1 amphotericin) and cultured in these dishes (Banker method).
Neurons were transfected with either 1 μg pEGFP–α-tubulin (Clontech cat. no. 632349) or pSkylan-NS–α-tubulin at 6–9 d in culture with Lipofectamine (2 µl, Life Technologies). pSkylan-NS–α-tubulin was created by exchanging the mScarlet sequence in the mScarlet–α-tubulin (Addgene plasmid #8504574) to Skylan-NS (Addgene plasmid #8678558) by Gibson assembly with a 0.005 U µl−1 T5 exonuclease (M0663S, NEB), 0.033 U µl−1 Phusion DNA polymerase (F-553L, Finnzymes) and 5.33 U µl−1 TAQ DNA ligase (MB42601, NZYTEch) master mix. Live-cell imaging was performed 24–48 h later. Before live imaging, neurons were transferred to Hibernate medium E (Brainbits), supplemented with 2% B27, 2 mM Glutamax and 0.4% d-glucose, and maintained in a humid chamber at 36 °C for the duration of the experiments (Okolab).
Hibernate-E Medium 是由Brainbits厂家推出的一种无血清基础营养培养基，专门用于在环境 CO₂ 条件下短期维持培养的大鼠神经元活力，以及长期保存存活的脑组织。国内代理商是靶点科技。Brainbits是该培养基配方的原始厂家。
主要特性与用途
•适用对象：专为胚胎神经组织（embryonic neural tissue）设计。与之对应的是 Hibernate-A，后者适用于出生后及成年神经组织 。
•环境适应性：补充 B-27 和 GlutaMAX-I 后，允许研究人员在环境 CO₂（非 5% CO₂ 培养箱条件）下操作神经元至少 48 小时，同时保持细胞高活力 。
•组织保存：可用于在 4°C 条件下保存存活脑组织长达 1 个月，也可作为运输介质运送包括脐带组织在内的各种生物样本 。
•渗透压差异：Hibernate-E 与 Hibernate-A 配方相似，但 Hibernate-E 的渗透压范围较低，更适合胚胎神经元 。
•维持生理功能：研究表明，在环境 CO₂ 条件下使用 Hibernate-E 培养的神经元，其对谷氨酸诱导的细胞内钙水平变化的反应能力与在标准 5% CO₂ 培养箱中培养的神经元相当，而普通 Neurobasal 培养基在环境 CO₂ 下会导致神经元活力大幅下降 。
•提高存活率：与环境 CO₂ 下的 Neurobasal 培养基相比，使用 Hibernate-E 培养的胚胎大鼠皮层神经元在 4 天后活力损失小于 10% 。
•补充剂：使用前需无菌添加 B-27 Supplement (2%) 和 GlutaMAX-I 。
•储存条件：未开封或补充后的培养基应储存在 2°C 至 8°C，避光保存。补充后的培养基在黑暗中可稳定保存长达一周 。
•货号信息：常见规格为 500 mL，目录号为HE-500 。
•授权代理商：靶点科技
