外周巨噬细胞高表达Gal3，且病灶处Gal3阳性细胞不共表达脑固有小胶质细胞标志物TMEM119，以上两点提示这类细胞经血液循环浸润至脑组织。因此，为改善脑微出血（CMB）后毛细血管丢失问题，本研究通过静脉注射荷兰Liposoma氯膦酸盐脂质体（CLR）耗竭小鼠循环巨噬细胞。
氯膦酸盐脂质体（ClodronateLiposomes：C-005）被循环吞噬细胞摄取后，会在吞噬溶酶体内降解，释放包裹的氯膦酸并诱导细胞凋亡。与预期结果一致，CLR 处理可显著耗竭血液中的单核细胞与中性粒细胞（图 6A），但对淋巴细胞、红细胞无明显影响（独立样本 t 检验，P=0.10）。研究同时发现，CLR 处理后小鼠脾脏 Gal3 阳性巨噬细胞数量大幅下降（图 6B、附图 S6A；独立样本 t 检验，P=0.0005）；而小胶质细胞特异性清除剂 PLX5622 对该类细胞无作用（图 6B）。静脉 CLR 仅靶向清除外周免疫细胞：与其他啮齿类动物研究报道一致，CLR 处理后小鼠大脑皮层小胶质细胞密度无显著改变（附图 S6B、C；单因素方差分析，F₂,₂₉=0.6762，P=0.5164）。
在证实 CLR 可有效清除血液循环及外周器官中能分化为浸润巨噬细胞的前体细胞后，本研究对糖尿病小鼠分别进行空白对照溶剂、CLR 给药处理；给药时间点为脑微出血造模前、造模当日及造模后第 2 天。首先验证：CLR 处理可显著抑制糖尿病小鼠病灶处 Gal3⁺/TMEM119⁻浸润巨噬细胞的募集浸润（图 6C、D；单因素方差分析，F₂,₈₇=14.48，P＜0.0001；图基多重比较检验：糖尿病组 vs 糖尿病 CLR 给药组，P=0.0344）。值得注意的是，CLR 不会改变病灶处 TMEM119⁺固有小胶质细胞（无论是否共表达 Gal3）的数量（图 6C、D；单因素方差分析，F₂,₈₇=0.7862，P=0.7862）。该结果进一步证实：脑内原生 TMEM119⁺/Gal3⁺小胶质细胞不会损伤血管修复进程，与外周浸润型 TMEM119⁻/Gal3⁺巨噬细胞作用相反。
糖尿病小鼠脑微出血病灶内 Gal3 免疫荧光染色面积显著扩大，且该信号与固有小胶质标志物 TMEM119 无共定位；而 CLR 给药可逆转该现象（图 6E；单因素方差分析，F₂,₆₂=45.49，P＜0.0001；图基多重比较检验：糖尿病组 vs 糖尿病 CLR 给药组，P＜0.0001）。
为进一步探究 CLR 对出血灶吞噬活性及相关信号蛋白的调控作用，本研究对脑微出血病灶进行成像定量检测，检测指标包括脂褐素含量、CD68、髓系细胞触发受体 2（TREM2）免疫荧光强度（文献 41）；前期基因表达谱分析已证实上述标志物表达上调（见图 4A）。结果显示：相较于空白溶剂处理的糖尿病小鼠，CLR 给药糖尿病小鼠脑微出血病灶中 GFP 阳性细胞聚集区对应的脂褐素荧光面积显著降低（图 6F；单因素方差分析，F₂,₁₂₁=4.313，P=0.0366；图基多重比较检验：糖尿病组 vs 糖尿病 CLR 给药组，P=0.0236）。
由于 Gal3 染色方案与 CD68、TREM2 染色存在实验冲突（抗原修复需高温处理、一抗宿主物种不匹配），本研究将三种蛋白的染色结果分开展示。CLR 处理可显著降低糖尿病小鼠病灶内 CD68 免疫荧光染色面积占比（图 6G、H；单因素方差分析，F₂,₅₁=5.857，P=0.0051；图基多重比较检验：非糖尿病组 vs 糖尿病组，P=0.0222；糖尿病组 vs 糖尿病 CLR 给药组，P=0.0078），但不改变 CD68 点状荧光的数量（图 6I；CD68 点状颗粒数量：单因素方差分析，F₂,₅₁=0.4932，P=0.6135）。糖尿病小鼠脑微出血病灶中 TREM2 表达同样升高，CLR 给药可显著下调其表达水平（图 6J、K；单因素方差分析，F₂,₅₁=7.112，P=0.0019；图基多重比较检验：非糖尿病组 vs 糖尿病组，P=0.0058；糖尿病组 vs 糖尿病 CLR 给药组，P=0.0051）。以上结果说明：糖尿病状态会提升出血灶吞噬活性与 TREM2 蛋白表达，而 CLR 干预可将二者下调至健康对照组正常水平。
为验证假说 ——Gal3 阳性巨噬细胞是体内决定血管最终转归的核心因素，本研究构建非糖尿病小鼠、糖尿病小鼠模型，分别设置 CLR 给药 / 空白对照；于脑微出血造模后连续 2 周活体成像，追踪 CX3CR1-GFP 标记的小胶质 / 巨噬细胞应答与微血管转归（图 7A）。活体实验结果显示：未经 CLR 处理的糖尿病小鼠，脑微出血后约 29% 微血管发生消亡；而 CLR 干预可将微血管消亡比例大幅降至 5%（图 7A、B）。对各组小鼠血管修复 / 消亡比例取均值后，同样观察到该趋势（图 7C）。
补充说明：糖尿病 CLR 给药组仅出现 2 例血管消亡（共 37 根观测血管），且全部来自同一只小鼠；其余 7 只接受 CLR 处理的糖尿病小鼠，脑微出血后微血管均实现 100% 修复（图 7B、C）。综上，上述活体实验证实：CLR 可阻断 Gal3 阳性巨噬细胞浸润出血病灶，进而抑制糖尿病小鼠脑微血管消亡。
图6. 氯膦酸脂质体干预可清除外周免疫细胞、减少TMEM119⁻/Gal3⁺细胞浸润，并降低出血灶处的吞噬活性
论文信息：
论文题目：Invasion of phagocytic Galectin 3 expressing macrophages in the diabetic brain disrupts vascular repair
期刊名称：Science Advances
时间期卷：Vol 7, Issue34(2021)
在线时间：2021年8月18日
DOI: 10.1126/sciadv.abg2712
产品信息：
货号：CP-005-005
规格：5ml+5ml
品牌：Liposoma
产地：荷兰
名称：Clodronate Liposomes&Control Liposomes
办事处：靶点科技
Clodronate Liposomes氯膦酸盐脂质体静脉注射，清除外周巨噬细胞。荷兰Liposoma巨噬细胞清除剂ClodronateLiposomes见刊于Science Advances：吞噬型半乳糖凝集素 3 阳性巨噬细胞浸润糖尿病小鼠脑组织会阻碍血管修复。
Liposoma巨噬细胞清除剂Clodronate Liposomes氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞的材料和方法：
In vivo macrophage depletion
For drug intervention experiments, mice received intravenous CLR (50 mg/kg; Liposoma B.V.) 2 days before CMB induction, on the day of CMB induction, and 2 days later. This treatment regimen ensured sustained depletion of peripheral macrophages. Diff-Quik histological staining confirmed depletion of circulating immune cells in treated animals.
药物干预实验中，于脑微出血造模前 2 天、造模当日及造模后 2 天，对小鼠尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体（CLR，给药剂量 50 mg/kg，厂商：Liposoma B.V.）。该给药方案可实现外周巨噬细胞的持续性清除。经迪夫快速（Diff-Quik）组织染色验证，给药小鼠外周循环免疫细胞已被有效清除。
巨噬细胞清除材料和方法文献截图：吞噬型半乳糖凝集素 3 阳性巨噬细胞浸润糖尿病小鼠脑组织会阻碍血管修复
